DNA甲基化对邻苯二甲酸单乙基己酯致小鼠睾丸间质细胞损伤的作用

摘要

目的 探讨邻苯二甲酸单乙基己酯[mono-(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP]染毒对小鼠睾丸间质细胞(TM-3)DNA甲基化和凋亡水平的影响.方法 体外培养小鼠睾丸间质细胞至对数生长期,预实验毒物浓度梯度设为0、50、100、200、400、800μmol·L-1,24 h染毒后,采用CCK-8法检测细胞活性,采用Graphpad prism 6.0计算细胞半数抑制剂量(IC50),并最终确定染毒剂量为0(对照组)、200、400、800μmol·L-1;光镜观察细胞形态学变化,采用5-甲基胞嘧啶抗体(5-methylcytosine,5-mc)免疫荧光法检测细胞总甲基化水平;采用RT-PCR检测甲基转移酶(DNMTs)中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA表达水平;采用Hoechst荧光染色检测细胞凋亡水平.结果 CCK-8结果显示:随着染毒剂量的增加,细胞存活率逐渐下降(P<0.05);光镜观察显示:正常细胞呈梭形、多边形等不规则形状生长,随着染毒剂量的增加,贴壁细胞数量逐渐减少,细胞核呈现空泡化,条索状细胞增多,且漂浮的死亡细胞数逐渐增加;5-mc免疫荧光结果显示:与对照组相比,200μmol·L-1组荧光信号最强,400μmol·L-1组次之,800μmol·L-1组最弱(P均<0.01),不同浓度MEHP暴露,均可引起TM-3细胞总甲基化水平降低(P均<0.01);RT-PCR结果显示:与对照组相比,200μmol·L-1组DN-MT1 mRNA(1.15±0.08)、DNMT3B mRNA(2.28±0.15)相对表达水平高于对照组(P<0.05或<0.01);400μmol·L-1组DNMT1 mRNA(0.83±0.05)低于对照组(P<0.01),DNMT3A mRNA(1.91±0.44)和DNMT3B mRNA(2.50±0.09)表达水平高于对照组(P<0.05或<0.01);800μmol·L-1组DNMT1 mRNA(0.50±0.08)低于对照组,DNMT3A mRNA(2.40±0.51)高于对照组(P<0.01);Hoechst33258荧光染色显示:与对照组相比,不同浓度MEHP暴露,均可诱导TM-3细胞凋亡(P均<0.01);400、800μmol·L-1两组可以观察到明显的染色质固缩,核浓染现象,凋亡细胞数目逐渐增多.结论 MEHP可引起TM-3细胞发生异常的甲基化修饰,进而导致细胞凋亡.