肿瘤相关肝星状细胞促进肝癌侵袭转移的机制及临床意义探讨

摘要

肝细胞癌(HCC)术后的高复发率、低生存率,严重制约肝癌术后的远期疗效.肝炎、肝硬化和HCC被认为是肝炎发展的三部曲.既往研究多重视肿瘤本身的侵袭特性对HCC术后复发的影响,而忽略了肝纤维化/肝硬化背景.深入研究肝纤维化/肝硬化对HCC复发的影响具有重要的临床意义.同时,肿瘤细胞上皮间质转化(EMT)是肝癌细胞播散导致肝内、肝外转移的关键因素,其在肝癌的侵袭、转移过程中发挥着重要作用. 而HSC也是HCC微环境中主要的间质细胞.深入研究肝癌微环境中HSC对肿瘤细胞的影响有着重要的临床意义和应用前景.已有几个研究报告显示HSC与HCC之间有着密切的联系.这些研究采用的是人或动物正常肝组织的HSC或细胞系,而这些肝星状细胞的细胞表型与肝癌组织内的HSC(肿瘤相关的HSC,tHSC)并不完全相同. 前期我们已经成功的分离和培养原代大鼠的肝星状细胞;同时发现一种中草药(淫羊藿素)具有抗肝纤维化保护作用,并可抑制HSC的活化.本课题着重从细胞体外实验到动物体内实验探讨肝癌组织中分离培养的tHSC与肿瘤细胞的关系、HSC影响肝癌细胞生存和侵袭转移的作用机制,同时通过检测肝癌组织中tHSC的表达及其肝癌预后的关系.这将有助于加深对肝癌转移复发机制的认识,而且为探索肝癌转移复发诊治新策略的研究提供新的视野. 第一部分 肿瘤相关肝星状细胞诱导肝癌细胞发生EMT样改变促进肝癌细胞侵袭转移的实验研究 研究目的： 已有的研究表明肝星状细胞与肝细胞癌之间有着密切的联系.这些研究采用的是人或动物正常肝组织的HSC或细胞系,而这些肝星状细胞的细胞表型与肝癌组织内的HSC(tHSC)并不完全相同.本课题分离、培养人肝癌组织中肿瘤相关的肝星状细胞(tHSC),探讨其对肝癌细胞的生物学行为影响及其相关机制,为进一步研究tHSC对HCC的作用提供实验理论. 研究方法： 在体外实验中,采用密度梯度离心法从新鲜人肝癌组织标本中分离肝癌组织内的HSC(tHSC),台酚蓝染色检测细胞活力、细胞免疫荧光鉴定活化tHSC表达α-SMA的特征、光镜观察tHSC形态学变化;收集tHSC条件培养液(tHSC-CM),与肝癌细胞系(PLC/PRF/5)共培养,采用ELISA检测条件培养液中细胞因子的含量、MTT细胞活力试验检测细胞的生长变化、Transwell实验检测细胞侵袭、细胞划痕实验检测细胞迁移、Western Blot检测EMT相关蛋白的表达. 在体内实验中,BALB/c裸鼠分别皮下接种肝癌细胞PLC/PRF/5单独或混合tHSC;建立肝癌裸鼠模型,第二周开始给予灌胃淫羊藿素治疗,观察裸鼠成瘤的质量和体积的变化,以及通过免疫组化检测Ki-67、CD34和EMT相关蛋白的表达. 实验结果： 1、分离的tHSC活率、纯度与鉴定 台酚蓝染色液检测分离的细胞活率在92%-96%以上,细胞纯度较高(95%-98%).tHSC含Vitamin A脂滴较少,很少能观察到蓝绿色的自发荧光.tHSC在培养板中呈现成纤维细胞样生长,并且其活化标志物α-SMA呈阳性表达. 2、tHSC条件培养液促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭 我们采用不同来源肝星状细胞24h条件培养液处理肝癌细胞PLC/PRF/5,结果显示：tHSC条件培养液(tHSC-CM)不仅具有显著增强细胞增殖的能力,并且呈现出时间和浓度依赖性,而且能够显著促进肝癌细胞的侵袭转移的能力. 3、tHSC条件培养液能够诱导肝癌细胞发生EMT样改变 肝癌细胞在tHSC-CM处理48h后形态发生明显改变,从多角形向成纤维细胞样改变,同时采用Western Blot和细胞免疫荧光检测EMT标志物E-cadherin表达下调和vimentin表达上调. 4、tHSC条件培养液能够体外诱导血管生成 管腔形成实验结果表明,tHSC-CM作用于HUVEC细胞6h后具有明显诱导其形成血管结构的能力. 5、ELISA检测条件培养液中细胞因子的含量 我们采用ELISA定量检测了不同肝星状细胞条件培养液中细胞因子TGF-β1、PDGF、HGF、VEGF的含量,结果发现：tHSC条件培养液中细胞因子的含量较其他各组均较高. 6、tHSC促进肝癌细胞体内成瘤性 裸鼠皮下成瘤实验结果显示：肝癌细胞PLC/PRF/5混合tHSC注射裸鼠皮下能够显著增强其成瘤性,促进肝癌细胞体内生长.同时其瘤体内肝星状细胞明显较多,α-SMA表达升高,E-cadherin表达下调,Ki-67和CD34表达升高. 7、淫羊藿素在体外抑制tHSC的增殖,在体内靶向tHSC抑制裸鼠的成瘤 在体外,MTT检测淫羊藿素对各种细胞的生长影响,结果表明tHSC对淫羊藿素反应敏感,其可抑制tHSC的生长和增殖,但对正常肝细胞无明显副作用.在裸鼠体内,观察到PLC/PRF/5+tHSC+淫羊藿素治疗组比其他组肿瘤生长速度慢,瘤体内肝星状细胞明显减少,α-SMA表达减低,而E-cadherin表达升高,Ki-67和CD34表达减低. 实验小结： 在体外实验中,从人肝癌组织中分离、培养的tHSC活力和纯度高;活化的tHSC条件培养液与肝癌细胞共培养,活化的tHSC可能通过旁分泌TGF-β、PDGF、HGF、VEGF等细胞因子,诱导肝癌细胞产生EMT样改变,促进肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移.在裸鼠动物体内实验中,活化的tHSC在裸鼠体内促进肝癌的生长、增殖和肿瘤新生血管生成.淫羊藿素在体外具有抑制tHSC的增殖作用,在体内淫羊藿素通过靶向tHSC从而抑制裸鼠肝癌细胞的增殖与新生血管生成. 第二部分 肿瘤相关肝星状细胞诱导肝癌细胞发生EMT样改变临床实验研究 研究目的： 研究肝癌组织HSC(tHSC)表达水平与临床病理的关系以及对肝癌术后预后的影响,为进一步研究tHSC对HCC的作用提供临床依据,为探索肝癌转移复发诊治新策略的研究提供新的视野. 研究方法： 回顾性统计2005.5-2006.6中连续接受根治性肝癌切除252例患者的详细临床病理资料,并进行长期复查和随访.组织免疫荧光对肝癌组织中tHSC的进行鉴定,免疫组化检测肝癌组织中tHSC的表达水平和EMT相关蛋白的表达,统计分析肝癌组织中tHSC表达水平和临床病理资料及其与临床预后的关系. 实验结果： 1、肝癌组织中tHSC的鉴定 采用组织免疫荧光法检测desmin和活化肝星状细胞特征性标志物α-SMA的表达情况,在肝癌组织中肝星状细胞基本都处于活化状态,同时表达α-SMA和desmin,与原代分离的tHSC体外鉴定结果相一致. 2、肝癌组织样本中tHSC的数量存在差异 通过免疫组织化学检测252例肝癌组织样本中α-SMA表达发现肝癌组织中活化肝星状细胞的数目存在明显差异.根据不同tHSC细胞数量我们可将252例肝癌组织分为0、1、2、3四级,0和1级定义为低密度tHSC组(55%,139/252),2和3级定义为高密度tHSC组(45%,113/252). 3、肝癌组织中存在EMT样改变 通过同时检测同一患者样本组织切片中α-SMA和EMT相关蛋白E-cadherin的表达情况,结果我们发现252例肝癌组织中检测到E-cadherin阳性表达的有46%(116/252),癌旁肝组织中检测到E-cadherin阳性表达的有75%(189/252).肝癌组织中E-cadherin阳性表达与tHSC的数量呈现负相关(r=-0.256,P<0.001). 4、tHSC诱导的EMT促进肝癌细胞的播散 我们检测了一些高密度tHSC的组织样本发现在癌巢边缘存在一些脱落的表达肝细胞标志物Hep Par1的肝癌细胞同时低表达或是不表达E-cadherin,这些散落的细胞可能就是从原发肿瘤中发生EMT存在播散和转移潜能的肝癌细胞. 5、tHSC与肝癌患者临床病理资料的相关性 根据材料部分活化肝星状细胞特征性标志物α-SMA高低表达的判断标准,252例患者中113例tHSC高密度组,139例tHSC低密度组.统计252例肝癌患者临床病理资料与tHSC的相关性发现,高密度tHSC与患者肿瘤大小,TNM分期和血管侵犯显著相关. 6、tHSC与肝癌预后的相关性 通过对252例肝癌组织中tHSC的表达水平与肝癌患者术后复发和生存的K-M曲线分析发现：高密度tHSC患者1、3、5年复发率显著高于低密度患者,1、3、5年生存率显著低于低密度tHSC患者. Cox多因素分析模型,结果显示：BCLC分级、TNM分期、血管侵犯和tHSC的表达水平是影响患者术后复发和生存的独立危险因素.故tHSC的表达水平是影响肝癌患者术后预后的主要因素之一. 实验小结： 肝癌组织中tHSC的表达水平与肝癌患者术后的复发和预后有关,tHSC可能通过诱导肝癌细胞发生EMT样改变促进肝癌患者术后出现肿瘤的复发和转移. 全文结论： 本课题成功从人肝癌组织中分离并培养tHSC,其在体内外能够通过诱导肝癌细胞发生EMT样改变,促进肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移.肝癌组织中tHSC的表达水平与肝癌患者术后的复发和预后有关,其作用部分机制可能通过tHSC诱导肝癌细胞发生EMT样改变.

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