Subfatin脂肪特异性过表达小鼠模型的构建及胰岛素敏感性研究

摘要

人们很早就知道脂肪组织是人体最大的储能器官，随着上个世纪九十年代Leptin（瘦素）的发现，人们逐渐意识到脂肪组织也是一个高度活跃的内分泌器官，它能分泌各种生物活性肽或蛋白质，统称为脂肪因子，参与调节机体许多重要的病理生理过程。
　　由于肥胖已成为全球性健康问题，是许多重要疾病的主要危险因子，而体内脂肪组织过多又是肥胖患者的重要特点之一，因此，了解脂肪因子与肥胖的关系，探索脂肪因子的具体生理功能，对治疗肥胖产生的病理学后果是非常有价值的。目前，人们对于脂肪因子的研究已取得许多重要进展，比如有学者提出用Leptin或Leptin联合低剂量胰岛素治疗糖尿病，有助于维持血糖稳态;前期大量研究证明Visfatin可以作为治疗脑卒中的新靶点，等等。
　　在过去二十年间，不断有新的脂肪因子被发现，目前科学界大概报道了超过100种脂肪因子。本室于2008年首次利用限食模型找到了一个新的脂肪因子，取名为Subfatin。
　　本室前期的初步试验结果表明:Subfatin在白色脂肪组织表达较高，其在限食大鼠的白色脂肪组织中表达下调，而在高脂饮食诱导的肥胖小鼠白色脂肪组织中表达上调，在脂肪细胞分化过程中表达逐渐升高。据此我们认为，Subfatin可能参与脂肪功能的调节，并影响肥胖及机体代谢。
　　制备脂肪细胞特异性过表达的转基因动物模型，是研究脂肪因子整体功能的可靠手段之一。为了研究脂肪细胞来源的Subfatin对脂肪组织生物学及代谢功能的影响，本课题构建了Subfatin脂肪特异性过表达小鼠模型，并对该小鼠模型的胰岛素敏感性进行了探索。
　　实验方法:
　　1.pBluescriptⅡ SK(+)-aP2-Subfatin质粒的构建
　　(1)利用pIRES-EGFP-Subfatin质粒PCR扩增获得Subfatin cDNA-his6，并将其插入pBS aP2 promoter(5.4 kb) polyA质粒，构建了pBluescriptⅡ SK(+)-aP2-Subfatin质粒，即Subfatin脂肪组织特异性过表达载体。
　　(2)对pBluescriptⅡ SK(+)-aP2-Subfatin质粒进行基因测序。
　　2.转基因小鼠的制备
　　(1)将线性化的载体片段（含aP2 promoter、Subfatin cDNA-his6、Poly A）显微注射进C57BL/6小鼠的受精卵中。
　　(2)将受精卵移植入C57BL/6假孕母鼠的输卵管壶腹部，监护假孕母鼠生产，鉴定F0代转基因小鼠的基因型。
　　(3)选出阳性首建鼠，与C57BL/6小鼠回交，获得F1代转基因小鼠，鉴定基因型。
　　3.转基因小鼠的表达验证
　　(1)应用半定量RT-PCR、Real-time PCR的方法检测Subfatin基因的转录情况。
　　(2)应用免疫组化的方法检测脂肪组织Subfatin蛋白的表达情况。
　　(3)用ELISA测定血清中Subfatin蛋白的浓度。
　　4.转基因小鼠的胰岛素敏感性研究
　　(1)在正常饮食和高脂饮食条件下对转基因小鼠的体重、食量进行称重。
　　(2)在正常饮食和高脂饮食条件下对转基因小鼠进行葡萄糖耐量实验(GTT)。
　　(3)在高脂饮食条件下对转基因小鼠进行胰岛素耐量实验(ITT)。
　　(4)在高脂饮食条件下对转基因小鼠进行高胰岛素性正糖(HIEG)钳夹实验。
　　结果:
　　1.基因测序结果表明，pBluescriptⅡ SK(+)-aP2-Subfatin质粒上aP2 Promoter-Subfatin区域的核苷酸序列分别与小鼠aP2 Promoter基因核苷酸序列及SubfatinmRNA编码序列一致。说明Subfatin脂肪组织特异性过表达载体构建成功。
　　2.对假孕母鼠产下的F0代转基因小鼠进行基因型鉴定，得到四只阳性首建鼠。
　　3.半定量RT-PCR结果表明，在所取的脑组织、肾组织、心脏组织、肌肉组织、棕色脂肪组织和白色脂肪组织中，外源性Subfatin(Subfatin-his6)只有在棕色脂肪组织和白色脂肪组织中是过表达的。
　　4.Real-time PCR结果表明，Subfatin在阳性转基因小鼠脂肪组织中的转录水平大大高于野生型小鼠，说明转基因小鼠脂肪组织中Subfatin是过表达的。
　　5.免疫组化的结果表明，Subfatin蛋白在阳性转基因小鼠白色脂肪组织中的表达明显高于野生型小鼠，同样说明转基因小鼠脂肪组织中Subfatin是过表达的。
　　6.ELISA的结果表明，Subfatin蛋白在阳性转基因小鼠血清中的浓度的确高于野生型小鼠，该结果与Subfatin蛋白的分泌性质相符合，同时也验证了其在转基因小鼠体内是过表达的。
　　7.在正常饮食或高脂饮食饲养条件下，转基因小鼠和野生型小鼠的体重、食量均无显著性差异。
　　8.GTT实验结果表明，在正常饮食饲养条件下，转基因小鼠和野生型小鼠的胰岛素敏感性无显著差异;而在高脂饮食饲养条件下，转基因小鼠的胰岛素敏感性明显高于野生型小鼠。
　　9.ITT实验、HIEG钳夹实验结果均表明，在高脂饮食饲养条件下，转基因小鼠的胰岛素敏感性明显高于野生型小鼠。
　　综上所述，本课题成功构建了Subfatin脂肪特异性过表达小鼠模型，并发现高脂饮食饲养条件下，转基因小鼠的胰岛素敏感性明显高于野生型小鼠，说明脂肪组织Subfatin能对抗高脂诱导的胰岛素抵抗。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 构建表达载体pBluescript Ⅱ SK(+)-aP2-Subfatin

一、引言

二、实验材料与方法

(一)目的基因片段的扩增与回收

(二)目的基因插入表达载体

(三)转化及质粒抽提

(四)鉴定阳性菌落

三、结果与讨论

(一)目的基因的扩增与回收

(二)阳性菌落鉴定结果

(三)阳性克隆测序

第二部分 Subfatin脂肪特异性过表达转基因小鼠的鉴定及培育

一、引言

二、实验材料与方法

(一)阳性首建鼠的基因鉴定

(二)转基因小鼠的mRNA表达检测

(三)转基因小鼠脂肪组织表达Subfatin蛋白的检测

(四)转基因小鼠血清中Subfatin蛋白的浓度测定

(五)转基因小鼠扩大繁殖

三、结果与讨论

(一)阳性首建鼠的确立

(二)各组织的RT-PCR结果

(三)Real-time PCR结果

(四)转基因小鼠脂肪组织Subfatin蛋白的检测

(五)转基因小鼠血清中Subfatin蛋白浓度的测定

(六)转基因小鼠的扩大繁殖

第三部分 转基因小鼠的胰岛素敏感性研究

一、引言

二、实验材料与方法

(一)体重、食量测定

(二)葡萄糖耐量实验

(三)血清中胰岛素浓度测定

(四)胰岛素耐量实验

(五)高胰岛素性正糖钳夹实验

三、结果与讨论

(一)体重、食量

(二)葡萄糖耐量实验

(三)胰岛素耐量实验

(四)高胰岛素性正糖钳夹实验

全文总结

参考文献

综述 胰岛素敏感性的测定技术

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

附录

致谢