长链非编码RNA在小鼠脂肪组织胰岛素抵抗中的表达谱特征及其对脂肪细胞胰岛素敏感性的影响

摘要

肥胖是目前发达国家和发展中国家共同面临的全球性公共卫生难题。内脏脂肪的堆积会导致代谢性疾病，包括心血管疾病和Ⅱ型糖尿病等。胰岛素抵抗是2型糖尿病和多种心血管疾病的共同发病机制。胰岛素抵抗是指细胞或组织对正常剂量的胰岛素反应性下降。引起胰岛素抵抗的原因有很多，包括肥胖相关的慢性炎症状态、脂代谢异常、肠道菌群失调等。对胰岛素信号通路的研究已经有很多，而最近又有新的研究发现转录调控和表观遗传学修饰在胰岛素抵抗的发生发展中也起着重要的作用。
　　长链非编码RNA(LncRNA)是转录本长度超过200个核苷酸的RNA，且大部分lncRNA几乎无编码蛋白质功能。所以最初这些RNA分子被认为没有生物学活性。但现在越来越多的研究发现lncRNA在许多生物学过程中起着作用，包括遗传学印记、转录激活、RNA剪切、核内运输等。LncRNA也能参与脂肪的形成与分化，有研究发现，某些lncRNA能与过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）结合参与调控脂肪的分化、生成。PPARγ的表达能影响抵抗素和一些促炎细胞因子的产生，从而与胰岛素抵抗相关。所以我们猜测lncRNA可能也参与调控了脂肪组织发生胰岛素抵抗的这一病理过程。
　　在本研究中，我们通过高脂喂养C57BL6小鼠12周来诱导产生胰岛素抵抗模型，在鉴定模型建立成功后，将小鼠附睾脂肪组织送第二代高通量测序，了解lncRNA在正常小鼠附睾脂肪组织以及发生胰岛素抵抗的脂肪组织中表达差异情况，从而筛选出对胰岛素抵抗可能有影响的lncRNA。随后，将小鼠3T3-L1前脂肪细胞诱导为成熟脂肪细胞，通过基因干扰技术体外沉默胰岛素抵抗脂肪组织中过表达的lncRNA，观察其对脂肪细胞胰岛素敏感性的影响。
　　第一部分长链非编码RNA在小鼠脂肪组织胰岛素抵抗中的表达谱特征
　　目的:
　　研究lncRNAs在小鼠正常和发生胰岛素抵抗的附睾脂肪组织中表达谱的差异特征。筛选与胰岛素抵抗相关的lncRNAs，为后续的研究提供基础。
　　方法:
　　将20只5周龄健康雄性C57BL6小鼠适应性喂养1周后，随机分为正常饮食组（NCD10只/组）和高脂饮食组（HFD10只/组）。NCD组用普通标准饲料(10％脂肪)喂养，HFD组用高脂饲料（60％脂肪）喂食12周来建立胰岛素抵抗模型。随后通过口服葡萄糖耐量试验(OGTT)和胰岛素耐量试验(ITT)来评估胰岛素抵抗模型是否成功。测量比较两组小鼠的体重、附睾脂肪重量。苏木精-伊红(HE)染色观察附睾脂肪细胞面积。Real-time PCR检测小鼠脂肪组织炎症指标白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α) mRNA表达。Western blotting检测脂肪细胞p-Akt(S473)和Akt蛋白表达。第二代高通量测序检测两组小鼠附睾脂肪组织中lncRNA的表达情况，并选择表达差异在3倍以上的lncRNA行Real-time PCR验证。对差异表达的lncRNA进行GO分析和KEGG通路分析。
　　结果:
　　与NCD组比较，HFD组小鼠体重及附睾脂肪重量明显增加(P＜0.01)，附睾脂肪细胞面积显著增加，糖耐量异常和胰岛素抵抗明显。Real-time PCR检测发现，HFD组附睾脂肪组织中IL-6和TNF-α表达显著高于NCD组(P＜0.01)。二代高通量测序发现，与NCD组比较，HFD组附睾脂肪组织中有71条lncRNA和2985条mRNA表达显著增高(P＜0.05);有145条lncRNA和2472条mRNA表达显著下降(P＜0.05)。Real-time PCR表达差异在3倍以上的lncRNA共15条，其表达趋势与高通量测序结果基本一致。GO分析结果提示差异表达的lncRNA主要涉及膜结合的细胞组分、蛋白绑定、催化酶的活性、细胞内各种化合物以及核酸的代谢过程等，KEGG通路分析结果提示差异表达的lncRNA参与的信号通路主要涉及酒精中毒、免疫炎症、癌症的转录失调、以及代谢途径等，与胰岛素抵抗相关。
　　结论:
　　高脂饮食可使得C57BL6小鼠发生胰岛素抵抗。长链非编码RNA表达谱在小鼠正常白色脂肪组织和发生胰岛素抵抗的白色脂肪组织中表达差异显著，提示lncRNA可能在脂肪组织胰岛素抵抗的发生发展中起重要作用。
　　第二部分 LncRNA对小鼠脂肪细胞胰岛素敏感性的影响
　　目的:
　　探讨根据第一部分筛选出的上调的lncRNAs在小鼠3T3-L1诱导分化的成熟脂肪细胞以及发生胰岛素抵抗的脂肪细胞中的表达差异情况，并观察其对葡萄糖摄取率、PPARγ、GLUT4、IL-6的mRNA表达和Akt蛋白及其磷酸化水平的影响
　　方法:
　　通过lmg/ml胰岛素、10mmol/L地塞米松、0.5mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)将小鼠3T3-L1细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞。油红O染色以及Real-timePCR检测脂肪细胞形成标志基因Fabp4和PPARγ的表达情况，鉴定是否为成熟脂肪细胞。采用400μmol/L棕榈酸(PA)刺激48小时建立细胞胰岛素抵抗模型。葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法比较正常对照组(CON)和棕榈酸刺激组(PA)葡萄糖的浓度并计算各组的葡萄糖摄取率，Real-time PCR检测两组脂肪细胞PPARγ、GLUT4、IL-6 mRNA的表达，Western blotting检测各组脂肪细胞Akt蛋白及其磷酸化水平。Real-time PCR检测根据第一部分实验结果筛选出的lncRNA在普通培养的脂肪细胞（CON组）和发生胰岛素抵抗的脂肪细胞（PA组）中的表达情况。根据Real-timePCR结果，选择在两组间表达差异明显的lncRNA，使用RNA干扰技术沉默相关lncRNA（siRNA组），选择与目的基因序列无同源性的siRNA作为阴性对照(NC组)。根据是否加棕榈酸将细胞分为以下四组，NC组，siRNA组，NC+PA组，siRNA+PA组，计算各组的葡萄糖摄取率，各组脂肪细胞PPARγ、GLUT4、IL-6mRNA的表达和Akt蛋白及其磷酸化水平。
　　结果:
　　小鼠3T3-L1前脂肪细胞经诱导分化为成熟脂肪细胞，油红O染色后于光镜下可见分化成熟的脂肪细胞内的脂滴被染成橘红色，Real-time PCR显示Fabp4和PPARγ的mRNA水平显著增加。PA刺激后，脂肪细胞的葡萄糖摄取率下降，PPARγ、GLUT4mRNA表达减少，IL-6 mRNA表达升高，Akt的磷酸化水平下降。在第一部分中筛选出来的15条上调的lncRNA中，有9条在体外培养的脂肪细胞中也存在PA组表达显著高于CON组的情况。通过对其中3条候选的lncRNA(Gm26870、Gpr137b-ps、TCONS_01864186)进行功能缺失性研究发现，用siRNA沉默Gm26870的表达能缓解PA引起的葡萄糖摄取率下降，并改善胰岛素抵抗引起的PPARγ、GLUT4 mRNA表达抑制和pAkt/Akt比值下降，减轻IL-6 mRNA的升高。
　　结论:
　　PA能引起小鼠脂肪细胞的胰岛素抵抗，lncRNA Gm26870可能具有调节胰岛素敏感性的作用。

目录

声明

致谢

摘要

主要缩略词

第一部分 长链非编码RNA在小鼠脂肪组织胰岛素抵抗中的表达谱特征

引言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二部分 长链非编码RNA对小鼠脂肪细胞胰岛素敏感性的影响

引言

1 材料及方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文结论

综述 LncRNA与代谢综合征相关疾病

作者简历