间充质干细胞在原发性肝癌形成前和形成后的不同作用及机制研究

摘要

目的：
　　近年来，肿瘤微环境对肝癌发生发展的作用越来越受到重视。肿瘤并不是简单孤立的由癌细胞增殖形成;相反，是由多种不同类型细胞参与的，组成异质性的交互复杂的组织。癌细胞可以招募正常细胞诱导其分化为肿瘤相关基质细胞，共同构成肿瘤微环境。
　　间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)具有对炎症损伤和肿瘤的趋向性，是肿瘤微环境的一个重要组成部分。但其对肿瘤的作用尚未明确，有的文献报道MSCs促进肿瘤发生发展，也有文献报道MSCs抑制肿瘤，可以作为新兴的抗癌药物/基因传递的载体用于治疗肿瘤。本课题通过研究MSCs在肝癌发生前后的作用及机制，为安全和有效应用MSCs治疗肝癌或者其它肝脏疾病提供有力证据支持。
　　本课题将从以下两方面展开:第一部分探讨间充质干细胞在肝癌发生的不同阶段对肝癌的影响;第二部分研究间充质干细胞在肝癌发生不同阶段起不同作用的机制。
　　方法：
　　第一部分 探讨间充质干细胞在肝癌发生的不同阶段对肝癌的影响。
　　在这一部分，我们首先建立二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠原发性肝癌模型，连续观察不同诱癌时间（0、4、8、12、16周）肝癌发生发展情况，并依此将DEN诱发肝癌的过程划分肝癌形成前（Initial stage，Is）和形成后(Progressive stage，Ps)。然后分别在肝癌形成前和形成后给予MSCs，通过对各组大鼠生存时间、肿瘤发生率、最大肿瘤体积及肿瘤数量等进行观察统计，分析MSCs对肝癌发生发展的影响。结果:1、DEN诱癌模型中，通过对各个时间点的肝脏结构、质地及H&E染色观察划分肝癌形成前为从诱癌0周到第9周，此时，肝脏仍无明显肿瘤生成;而第9周到第17周则可以被归为肝癌形成后。2、与同时间DEN诱癌组相比，在肝癌形成前给予MSCs肿瘤发生率、最大肿瘤体积及肿瘤数量明显降低，生存期延长;而在肝癌形成后给予MSCs最大肿瘤体积及肿瘤数量则明显增加，生存期缩短。
　　第二部分 研究间充质干细胞在肝癌发生不同阶段起不同作用的机制。
　　为了探讨MSCs在肝癌形成前抑制肝癌发生是否由于MSCs对肝脏损伤具有保护作用，我们分别检测诱癌第8周时DEN组和DEN+MSCs(Is)组的大鼠肝功能(ALT、AST)和肝脏细胞凋亡(Tunel)情况，结果:DEN+MSCs(Is)组ALT和AST低于DEN组，且肝脏细胞凋亡明显减少;另外，我们的研究发现MSCs能够抑制DEN诱癌大鼠肝脏细胞ROS累积和DNA损伤。H&E染色发现，DEN+MSCs(Is)组汇管周围募集的淋巴细胞较少;且Bio-plex和Q-PCR检测结果显示，DEN+MSCs(Is)组肝脏组织中炎症因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ和IL-6明显低于DEN组。通过天狼星红染色和α-SMA探针标记发现DEN+MSCs(Is)组中肝星状细胞激活减少，肝脏组织纤维化程度降低。
　　接下来我们探讨MSCs在肝癌形成后促进肝癌发生发展的机制，我们分别检测诱癌第14周时DEN组和DEN+MSCs(Ps)组肝癌组织中细胞凋亡(Tunel)和增殖（Ki67）情况，发现上述两组细胞凋亡数目无显著性差异，而DEN+MSCs(Ps)组中大鼠肿瘤细胞增殖数目明显高于DEN组，呈增殖活跃状态;同时，我们发现DEN+MSCs(Ps)组肝癌组织中EpCAM和AFP表达增高，提示肿瘤干细胞比例增多;且较DEN组，DEN+MSCs(Ps)组Ecadherin表达明显减少而Vimentin表达增高，提示MSCs可能促进肝癌细胞发生EMT。进一步通过体外实验发现在TNF-α/IFN-γ刺激下，MSCs对肝癌干细胞和肝癌细胞发生EMT有明显促进作用。
　　结论：
　　综上所述，结合两部分研究结果，可以得出以下结论:
　　1、间充质干细胞在肝癌发生的不同阶段对肝癌作用不同，在肝癌形成前具有抑制肿瘤发生的作用，而在肝癌形成后则具有促进肿瘤发展的作用。
　　2、 MSCs在肝癌形成前抑制肿瘤发生可能是由于MSCs抑制肝脏细胞ROS累积和DNA损伤，并减弱炎症效应和抑制肝纤维化，最终抑制肝癌发生。而在肝癌形成后促进肿瘤发展很可能是由于MSCs受到肿瘤微环境中炎症因子TNF-α/IFN-γ等作用，转变为肿瘤相关间充质干细胞，促进肿瘤细胞增殖，促进肿瘤干细胞激活和肝癌细胞发生EMT，最终导致肿瘤恶性发展。

目录

声明

摘要

中英文缩略词对照表

第一部分 间充质干细胞在肝癌发生的不同阶段对肝癌发生发展的影响

一、材料与方法

(一) 实验材料

(二)实验方法

二、实验结果

(一)DEN诱癌过程中大鼠肝脏病理学变化

(二) 间充质干细胞具有向肝脏损伤部位趋化能力

(三) MSCs在肝癌发生不同阶段对肝癌发生发展的影响

三、讨论

参考文献

第二部分 间充质干细胞在肝癌发生不同阶段起不同作用的机制

一、材料与方法

(一) 实验材料

(二)实验方法

二、实验结果

(一) MSCs在肝癌形成前抑制肝细胞凋亡

(二) MSCs在肝癌形成前抑制肝脏细胞DNA损伤和ROS累积

(三) MSCs在肝癌形成前抑制肝脏炎症效应

(四) MSCs在肝癌形成前抑制肝星状细胞激活和肝纤维化

(五) 体外MSCs抑制淋巴细胞和肝星状细胞增殖

(六) MSCs在肝癌形成后促进肿瘤细胞增殖

(七) MSCs在肝癌形成后激活肿瘤干细胞并促进肝癌细胞EMT

(八)TNF-α／IFN-γ预处理MSCs增强其对肝癌细胞增殖的促进作用

(九)TNF-α／IFN-γ预处理MSCs增强其对肝癌干细胞的激活

(十)TNF-α／IFN-γ预处理MSCs促进肝癌细胞发生EMT

三、讨论

参考文献

附录

综述 SIRT1对免疫调节作用的研究进展

个人简历

在校期间发表论文及科研情况

在校期间获奖情况

致谢