乙肝病毒X蛋白与核受体FXR和PXR相互作用及信号传导通通路在原发性肝癌中的作用机制研究

摘要

第一部分
　　研究发现，乙肝病毒x蛋白HBx和核受体法尼酯X受体FXR(FarnesoidXreceptor，NRlH4)与肝细胞再生和原发性肝癌发生密切相关。然而，FXR或FXR信号通路在HBV感染相关HCC中的作用机制不甚明了。我们采用HBx稳定表达和瞬时过表达小鼠模型、荧光素酶报告系统、GST-pulldown、Co-IP、ChIP、EMSA等系列实验，发现HBx通过蛋白—蛋白相互作用影响FXR，进而激活FXR的转录，调控FXR信号通路下游靶基因的表达。进一步发现HBx结合到FXR上的分子模式可能是通过形成FXR/HBx/RXR异源三聚体来实现的。主要表现为HBx羧基端的α螺旋可以与FXR氨基端的AF1结构域结合，而HBx氨基端的α螺旋与RXR的LBD结合。EMSA实验结果提示，HBx调控FXR或FXR信号通路可能是通过HBx促进FXR/RXR结合到FXRE上实现的。为进一步探讨HBx与FXR相互作用的分子机制，我们通过构建HBx缺失突变体发现HBx羧基端的α螺旋在结合和激活FXR或FXR信号通路中发挥重要作用。结合已有的文献报道，我们比较和分析了HCC临床肝癌样品中HBX、FXR及FXR信号传导通路中相关基因的表达谱，发现HBx羧基端截短体普遍存在，且癌和癌旁FXR和FXR信号通路相关基因差异显著。此外，我们的实验结果还发现，HBx羧基端截短体（第三个α螺旋结构缺失）不但会丧失增加FXR/RXR异源二聚体的DNA结合能力，而且激活FXR转录活性的能力也显著下降。基于FXR可能是HCC的保护因素，我们分析了HBx/HBx羧基端截短体、FXR与NF-κB、炎症因子和HCC的关系。初步发现iNOS可能是其中的一个潜在靶点。据此，推测HBx羧基端截短体与FXR的相互作用可能与HCC的发生关系密切。
　　综上，考虑到全长的HBx作为FXR或FXR信号通路的一个辅因子，可以通过增强FXR/RXR结合到FXRE上，并激活FXR及相关信号通路，发挥抑制炎症的作用;而HBx羧基端截短体通常会丧失有效调节FXR和FXR信号通路的功能。基于HCC病人中HBx羧基端截短体和全长HBx共存的事实，我们认为，HBx羧基端截短体和全长HBx通过对FXR信号通路的不同影响，在HCC的发生发展中具有重要作用。
　　第二部分
　　HBx是HBV感染相关HCC发生的重要因素，但其分子作用机制不清。PXR(Pregnane(X)receptor,NR1(I)2)是核受体超家族中亚家族1的一个重要成员，广泛分布于肝、结肠和小肠等组织。其功能主要与体内许多内源性或外源性的化学物质清除、药物间相互作用的关键性调控有关。我们的研究发现HBx以配体依赖的方式增强PXR的转录活性，而且这种转录激活呈剂量依赖关系。我们先后通过Co-IP和GST-pulldown手段分别从invivo和invitro水平证实:HBx和PXR间存在蛋白—蛋白间相互作用。哺乳动物细胞双杂交、GST-pulldown进一步揭示PXR和HBx间相互作用主要定位于PXR的LBD。尽管EMSA实验结果提示，HBx、PXR/XR与PXRE间的蛋白—DNA相互作用不同于HBx和FXR/RXR与FXRE间的作用，但瞬时共表达的HBx和PXR可以显著上调PXR靶基因—药物Ⅰ相代谢酶中的CYP3A4的mRNA水平;HCC组织标本中PXR和PXR相关靶基因在癌和癌旁的差异表达结果等提示我们:HCC中HBx的表达可能与PXR信号通路的异常相关。我们的研究结果提示:HBx和PXR间的相互作用可能是解释HCC中HBV感染因素和化学致癌两大危险因素相互网络中的一个重要节点，或为肝癌解毒及代谢异常在HCC发生发展中的作用、HBV相关HCC的发生机理提供线索。

目录

声明

PREFACE

摘要

缩略词表／ABBREVIATIONS

图片列表(LIST OF FIGURES)

第一部分 乙肝病毒X蛋白与核受体FXR相互作用及信号传导通路在原发性肝癌中的作用机制研究

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 HBx与核受体PXR信号通路在原发性肝癌中的作用

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

综述

附录A(APPENDIX A)

附录B(APPENDIX B)

附录C(APPENDIX C)

致谢

攻读博士学位期间发表及待发表论文