基于c-FLIP和内质网应激通路相互作用探讨解毒方改善索拉非尼耐药的作用机制

摘要

背景:索拉非尼(Sorafenib，Sora)是临床上治疗中晚期肝癌推荐使用的分子靶向治疗药物，但是在治疗过程中会出现各种副作用，更重要的是，有相当一部分病人会对sorafenib产生耐药。当前针对sorafenib耐药的机制研究纷繁复杂，涉及诸多信号通路和生物分子，然而目前的研究尚不能全面揭示sorafenib耐药的机制。文献报道，sorafenib可以激活CD95/Fas诱导外源性凋亡，而caspase-8是外源性凋亡途径中重要的起始蛋白，caspase-8激活后可以引起一系列级联反应。c-FLIP是caspase-8的重要抑制蛋白，在许多肿瘤中高表达，与凋亡抑制密切相关。同时c-FLIP位于内质网(Endoplasmic reticulum，ER)膜上，具有调节内质网应激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)的作用，而后者与肿瘤发生发展密切相关，参与化疗药物抵抗。由此我们设想，c-FLIP/ERS信号通路是否参与调节sorafenib耐药，是引起sorafenib耐药的机制之一？同时，课题组成员在中医药防治肝癌方面具有一定的研究基础且具有丰富的临床经验，并在长期的临床研究中总结经验和用药，归纳出中药小复方“解毒方”(Jiedu Fang，JDF)，以此方为基础开展的多中心临床研究发现，可以延长晚期肝癌患者的生存期，尤其是部分sorafenib耐药或者副作用较大的病人。中医药在逆转肿瘤化疗耐药方面具有独特的优势，那么中药小复方“解毒方”能否可以改善索拉非尼耐药，其机制是否涉及调节c-FLIP/ERS?
　　研究目的:1.构建sorafenib耐药人肝癌细胞株，并观察sorafenib对敏感/耐药肝癌细胞增殖和凋亡的影响。2.分别观察sorafenib对敏感/耐药肝癌细胞株ERS及下游凋亡和自噬通路的作用，并研究c-FLIP对ERS和相关凋亡通路的影响，探讨其调节耐药的可能机制。3.体外探讨解毒方改善sorafenib耐药是否通过调节c-FLIP与ERS相关通路发挥作用。4.进一步在体内论证解毒方联合sorafenib对于耐药肝癌细胞皮下移植瘤的抑制作用。
　　研究方法:1.采用HepG2、Huh7肝癌细胞，通过MTT筛选sorafenib药物浓度，选择略低于IC50的药物浓度开始长期持续的sorafenib药物干预，诱导为HepG2-R、Huh7-R耐药肝癌细胞株，通过MTT、流式分别检测细胞增殖、凋亡，验证耐药细胞株HepG2-R、Huh7-R是否构建成功。2.观察ERS相关通路在sorafenib耐药中的作用，并采用ERS抑制剂4-苯基丁酸（4-Phenylbutyric acid，4-PBA）反相验证，进一步比较敏感株和耐药株中ERS引起的凋亡及自噬情况，WB检测相关蛋白表达，电镜下观察自噬体的形成，研究ERS在sorafenib耐药中的作用。3.根据ERS对相关凋亡通路的影响，观察凋亡抑制蛋白c-FLIP在sorafenib耐药中的作用，并采用siRNA干扰技术及过表达技术进行验证。4.体外观察解毒方对sorafenib耐药的改善作用，并通过Westernblot检测联合用药对c-FLIP和ERS蛋白的影响，探讨其可能机制。5.通过构建soranfenib耐药人肝癌细胞株皮下移植瘤裸鼠模型，在体内观察解毒方改善sorafenib耐药作用及可能机制。
　　结果:1.成功构建sorafenib耐药人肝癌细胞株HepG2-R、Huh7-R，sorafenib培养浓度分别为6.0μM、9.0μM。Sorafenib处理后，计算HepG2-R、HepG2的IC50，48h时分别为18.17μM、9.26μM，72h时分别为12.74μM、6.48μM，Huh7-R、Huh7的IC50，48h时分别为23.36μM、10.13μM，72h时分别为16.88μM、5.84μM，各组间的差异均具有统计学意义(P＜0.05);流式分别检测耐药株和敏感株的结果与MTT结果相一致，48小时耐药株凋亡率明显低于敏感株(P＜0.05);进一步检测凋亡相关蛋白发现，在相同浓度的sorafenib作用下，敏感细胞中的PARP、caspase-8、caspase-3激活比耐药株更明显。
　　2.研究ERS在sorafenib耐药过程中的作用，通过比较敏感/耐药细胞ERS相关蛋白发现，耐药细胞IRE1和PERK信号通路激活程度更高，部分ERS蛋白表达水平更高，使用ERS抑制剂4-PBA可以使耐药株对sorafenib的敏感性增加，降低PERK、Bip的表达水平，上调Chop水平，凋亡蛋白caspase-8、caspase-9、caspase-3、PARP活化。但是对ERS凋亡相关caspase-12的影响不明显。进一步研究ERS相关自噬发现，与敏感株比较，耐药细胞自噬水平较高，P62表达减少，LC3Ⅱ表达明显增加，ERS抑制剂4-PBA联合sorafenib能够使P62增加，使LC3Ⅰ向Ⅱ转化减少，电镜观察到了相似的结果，耐药株与sorafenib处理组可以看到较多的自噬体，而4-PBA处理后，自噬体数量则明显减少;分别给予自噬抑制剂3-Methyladenine(3-MA)和Chloroquine(CQ)处理耐药株后，sorafenib对耐药株的增殖抑制率和凋亡率明显增加。
　　3.通过比较敏感株和耐药株中凋亡蛋白caspase-8、caspase-9、caspase-12，我们发现，caspase-8在经过sorafenib处理的敏感细胞中被显著激活，而在耐药株中则不易被激活，因此我们进一步观察caspase-8抑制蛋白c-FLIP在sorafenib耐药中的作用。Sorafenib处理后，耐药细胞中c-FLIP的表达要高于敏感细胞;采用siRNA干扰c-FLIP后，无论是耐药的Huh7-R细胞还是HepG2-R细胞对sorafenib的敏感性都显著增加，c-FLIP siRNA组与NC组比较，细胞增殖抑制率和凋亡率增加(P＜0.05);进一步观察c-FLIP siRNA干扰对ERS相关蛋白和caspase-8的影响，经过sorafenib处理，HepG2-R的PERK、Bip水平降低，Chop水平升高，caspase-8剪切体明显增多，表明c-FLIP在调节耐药细胞的ERS相关通路和抑制caspase-8激活方面发挥了重要作用。过表达c-FLIP后，可以降低解毒方联合sorafenib对于耐药细胞的抑制作用，进一步证实，解毒方通过降低c-FLIP改善sorafenib耐药。
　　4.解毒方在体外可以改善sorafenib耐药。将不同浓度的解毒方(JDF0.1mg/ml、JDF0.2mg/ml、JDF0.4mg/ml)、sorafenib(Sora2.5μM、Sora5μM、Sora7.5μM)以及解毒方(JDF0.2mg/ml、JDF0.4mg/ml、JDF0.5 mg/ml)、sorafenib(Sora5μM、Sora10μM、Sora15μM)分别作用于耐药HepG2-R和Huh7-R细胞48h，未发现明显的增殖抑制作用，存活率均大于80％(P＞0.05)。而将不同浓度的JDF与sorafenib联合应用，则可以显著增加sorafenib耐药株的抑制率，差异具有统计学差异(P＜0.05)，且成一定的浓度依赖性，通过计算联合作用指数(combined index，CI)，CIHepG2-R=0.58(JDF0.4mg/ml+Sora5μM)，CIHuh7-R=0.33(JDF0.5mg/ml+Sora5μM)，表明JDF和sorafenib具有一定协同作用。Western blot检测发现，JDF和sorafenib联合作用后，c-FLIP表达降低，且呈浓度依赖性，PERK通路激活，Chop水平上调。
　　5.体内结果提示，JDF联合sorafenib可以显著抑制耐药细胞皮下瘤生长。构建Huh7、Huh7-R皮下移植瘤裸鼠模型，两组裸鼠给予低剂量sorafenib干预约4周后，仅Huh7-R组裸鼠出现皮下移植瘤，Huh7组未见明显皮下瘤，表明体内耐药模型构建成功，分别给予Vehicle、Sorafenib、JDF+Sorafenib、JDF干预15天后，Sorafenib与JDF组的瘤重与Vehicle组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，而JDF+Sorafenib组瘤重低于Vehicle组瘤重，且差异具有统计学意义(P＜0.05)，通过Western Blot检测肿瘤组织中的蛋白表达发现，JDF联合sorafenib能够激活IRE1和PERK通路，上调促凋亡chop蛋白水平，同时抑制c-FLIP表达，激活caspase-8，与体外结果一致。此外，各组裸鼠肝肾组织病理结果提示，本实验中JDF与sorafenib联合应用无体内毒性。
　　结论:1.索拉非尼耐药与c-FLIP高表达引起的caspase-8激活抑制、ERS激活继而自噬增强，而凋亡受抑制有关。
　　2.解毒方改善索拉非尼耐药，其机制与调节c-FLIP/ERS有关。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 索拉非尼耐药机制及解毒方改善索拉非尼耐药的体外研究

材料和方法

结果

第二部分 解毒方改善索拉非尼耐药的体内研究

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

文献综述 肝细胞癌索拉非尼耐药机制及应对策略的研究进展

攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢