基于大鼠睾丸细胞三维共培养模型的雄性生殖毒性测试系统建立

摘要

目的：
　　生殖和发育功能障碍是当前严重影响人体健康的主要公共卫生问题之一。现行各类化合物的生殖毒性评价主要采用整体动物试验方法，但以整体动物为基础的生殖毒性测试评价方法不符合“3R”原则，不能完全满足安全性或危险性评价发展的需求。建立更好地吸收融合现代生物技术、能提供更多机制信息、能转化应用于人体的体外毒性测试评价方法成为发展趋势。睾丸是外源性化合物雄性生殖毒性最敏感的器官，雄性生殖的主要功能精子发生和性激素的生成也由睾丸完成。因此，睾丸成为建立雄性生殖毒性体外测试方法时优先考虑的器官。目前国内外已建立了多种睾丸细胞体外毒性测试方法，存在的主要问题包括，单个细胞的试验只能对该细胞的特异毒性及其机制进行研究，难以作为睾丸毒性的评价方法;尚不能观察对生精细胞分化即精子生成的影响。因此，建立能涵盖睾丸主要细胞Sertoli细胞、Leydig细胞和生精细胞功能，特别是能观察生精细胞分化的研究模型成为近年来研究努力的方向。
　　近年来，在睾丸细胞生物学领域取得两项重要进展，一是用细胞外基质作为支架成功实现了能更好维持睾丸主要体细胞功能的三维短期共培养;二是发现血清替代物(knockOut serum replacement，KSR)能够促进胚胎干细胞和精原细胞的增殖及精原细胞向初级精母细胞分化。基于此，我们推测如将两项成果加以综合，加之培养条件的优化，有可能建立稳定的既能观察睾丸主要体细胞功能，又能观察生精细胞分化功能的研究模型。本研究的思路是拟采用细胞外基质作为3D培养支架，以KSR作为血清替代物，对睾丸Sertoli细胞、Leydig细胞和生精细胞进行共培养;再通过选择比较不同的培养方式、延长培养时间、优化培养条件，建立既能观察Sertoli细胞和Leydig细胞功能变化，又可以观察精原细胞分化的大鼠睾丸细胞三维共培养模型;然后研究其作为睾丸体外毒性测试系统的适用性。目的是为建立既可作为评价各类化学物对大鼠睾丸主要体细胞功能影响，还可观察对精子发生影响、能提供更多毒作用机制信息的大鼠睾丸体外毒性测试系统奠定基础。
　　方法：
　　1、大鼠睾丸细胞3D共培养模型的建立:选择6日龄SD大鼠，处死取出睾丸，清洗去白膜，经过系列酶消化获得细胞悬浮液，经100目筛网过滤，用台盼蓝鉴定存活率，以原比例混合共培养方式在37℃、5％ CO2培养箱中培养。获取细胞当天为d0。采用细胞外基质(extracellular matrix，ECM)作为三维支架，KSR作为常规胎牛血清FBS的替代物，以细胞增殖能力、睾酮含量、乳酸盐分泌量和生精细胞减数分裂特异性基因Stra8和Sycp3作为该模型初步成功与否的判断指标。通过对不同浓度的ECM和HCG、不同密度的细胞、不同日龄的乳鼠，不同时长的共培养周期的比较确定适宜的实验条件。为评价共培养模型的效果，与采用常规胎牛血清的3D共培养方式(FBS+ECM)和未采用ECM的2D共培养方式(KSR-ECM)进行比较。
　　2、大鼠睾丸细胞3D共培养模型作为雄性生殖毒性测试系统适用性的初步验证:选用欧洲替代方法验证中心推荐的双酚A(BiphoneA，BPA)和邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl Phthalate，DBP)作为阳性物，观察不同作用时间（8、16和24天）和暴露浓度（BPA:0、17.85、37.5和75μM; DBP:0、6.25、12.5和25μM）验证该模型作为毒性测试系统的可行性。
　　3、新药HZ1006长期毒性研究和基于大鼠睾丸细胞3D共培养模型的睾丸毒性研究:对新药(代号为HZ1006)进行SD大鼠和Beagle犬的28天长期毒性试验，大鼠:20、60和120 mg/kg，犬:20、40和80 mg/kg，经口给药，连续28天，恢复期大鼠2周，犬4周。选择HZ1006不同暴露时间（8、16和24天）和暴露浓度（0、3.125、6.25、12.5和25μM），采用所建测试系统对HZ1006潜在的体外雄性生殖毒性及其作用机制进行应用研究。
　　结果：
　　1、大鼠睾丸细胞3D共培养模型的建立:结果显示睾丸细胞分离存活率在95％以上，三种主要细胞维持了良好的生长增殖情况，从乳酸盐、睾酮分泌量和生精细胞分化情况来看，睾酮和乳酸盐分泌量30天稳定，生精细胞d24-d26期间内开始检测到了减数分裂特异标志，显示培养物在共培养期间三种主要细胞不仅生长良好，而且保持了良好的细胞功能。培养条件优化结果显示200μg/ml的细胞外基质浓度、5×105/ml的细胞密度、10 IU/ml HCG，出生后6天的乳鼠和26天的培养周期被确定为适宜的实验条件。与FBS+ECM的3D共培养和KSR-ECM的2D共培养方式比较结果显示，本试验培养方式的细胞增殖能力增强，细胞生长良好，细胞之间形成紧密连接;睾酮和乳酸盐分泌量明显提高且分泌较为稳定;在d24-d26期间开始检测到了生精细胞第一次减数分裂特异标志（Sycp3和Stra8基因和蛋白）。
　　2、大鼠睾丸细胞3D共培养模型作为雄性生殖毒性测试系统适用性的初步验证:结果显示BPA和DBP可抑制睾酮的分泌，BPA和DBP对睾酮分泌量的影响具有明显的时间和剂量依赖性。不同浓度BPA和DBP对类固醇激素合成相关基因Star的表达水平也有明显影响，随着浓度增加Star基因和蛋白表达量下降，有明显的剂量-效应趋势。BPA和DBP可使乳酸盐分泌量下降，对乳酸盐分泌量的影响具有明显的时间和剂量依赖性。不同浓度的BPA和DBP对雄激素转运蛋白基因(Abp)的基因和蛋白表达水平有明显影响，随着浓度增加Abp表达量下降，有明显的剂量-效应趋势。不同浓度BPA和DBP作用24天后，可对生精细胞减数分裂特异性基因Stra8和Sycp3的表达造成不同程度的影响，对Stra8和Sycp3基因和蛋白表达的抑制作用有明显的剂量-效应趋势。结果还显示，BPA最敏感的靶细胞是Sertoli细胞，可能首先引起Sertoli细胞功能改变，而DBP最敏感的靶细胞是Leydig细胞，可能首先引起Leydig细胞功能改变，进而影响其他生殖细胞功能。
　　3、新药HZ1006长期毒性研究和基于大鼠睾丸细胞3D共培养模型的睾丸毒性研究:40mg/kg以上剂量的HZ1006可引起犬雄性生殖毒性，表现为睾丸、附睾和前列腺的病理改变。其中睾丸的病理改变包括生精小管管腔偏小，数量也较少，生精细胞层次单一，数量明显减少，只能见到精原细胞和部分初级精母细胞，次级精母细胞、各级精细胞、成熟精子罕见。但大鼠未观察到明显的雄性生殖毒性。体外实验结果显示，HZ1006对共培养细胞24 h、48 h和72 h的细胞毒性(IC50)分别为325.19、277.17和149.64μM。HZ1006抑制细胞增殖，对细胞增殖能力的影响有一定时间和剂量依赖性。HZ1006可抑制睾酮的分泌，对睾酮分泌量的影响具有明显的时间和剂量依赖性。不同浓度HZ1006作用24天后，可对生精细胞减数分裂特异性基因Stra8和Sycp3的表达造成不同程度的影响，对Stra8和Sycp3基因和蛋白表达的抑制作用有明显的剂量-效应趋势。试验还观察到HZ1006可致AR蛋白水平及其靶向基因PSA表达水平的下降，Hdac6表达下降。
　　结论：
　　1、成功建立了既能观察Sertoli细胞和Leydig细胞功能变化，又可以观察生精细胞增殖分化，可作为研究大鼠睾丸主要细胞生物学功能的3D体外共培养模型。目前国内外尚未报道。
　　2、验证结果显示大鼠睾丸细胞3D共培养模型可有效检测出BPA和DBP对雄性睾丸细胞已知的各类毒作用，并可更准确地确定靶细胞等，为机制研究提供更多信息。初步表明该模型可作为雄性生殖毒性的测试系统及其毒作用机制的研究模型。
　　3、新药HZ1006在40mg/kg以上剂量经口给药可引起犬雄性生殖毒性，表现为睾丸、附睾和前列腺的病理改变。但对大鼠未观察到明显的雄性生殖毒性。HZ1006在体外可导致睾丸毒性，这与长期毒性试验中HZ1006犬睾丸毒性结果是一致的，其作用靶细胞可能是Leydig细胞，由于影响睾酮分泌，进而影响精子生成。初步的机制研究提示HZ1006引起的生殖毒性改变可能与其对Hdac6的抑制作用有关，表现为AR蛋白水平的降低及其靶向基因水平的下降。研究结果为HZ1006的毒性评价和机制研究提供了新的实验依据;也证实了所建模型作为雄性生殖毒性测试系统适用性。
　　4、本研究初步建立的基于大鼠睾丸细胞3D共培养模型的雄性生殖毒性的测试系统有良好的潜力发展成为新的毒性测试方法，有必要做进一步的完善和验证研究。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

第一部分 大鼠睾丸细胞三维共培养模型的建立

一、材料与方法

二、结果与分析

三、讨论

四、小结

第二部分 大鼠睾丸细胞三维共培养模型作为生殖毒性测试系统的初步验证

一、材料与方法

二、结果与分析

三、讨论

四、小结

第三部分 新药HZ1006长期毒性研究和基于大鼠睾丸细胞三维共培养模型的睾丸毒性研究

一、材料与方法

二、结果与分析

三、讨论

四、小结

参考文献

文献综述 睾丸体外毒性试验方法的研究进展和发展动向

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致谢