长链非编码RNA-n346372在膀胱癌发生发展中的作用及相关基因研究

摘要

目的:
　　1.基于全转录组高通量测序结果，筛选在膀胱癌组织与癌旁组织中显著差异表达的lncRNA分子;
　　2.验证lncRNA-n346372在膀胱癌组织与癌旁组织，膀胱癌细胞系中的表达差异情况，以及与患者临床病理信息的相关性;
　　3.探讨lncRNA-n346372在膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡等生物学功能中的作用;
　　4.进一步分析验证lncRNA-n346372与mRNA Cyclin B1的相关性，预测可能涉及的调控网络。
　　方法:
　　1.通过新一代测序技术，对10对膀胱癌组织/癌旁组织进行全转录组高通量测序，采用Wilcoxon rank sum test、DESeq2、EdgeR等统计学分析方法，以p＜0.05、fdr＜0.05、log2FoldChange＞2为筛选策略，对测序结果中差异表达的lncRNA进行再次筛选，为后续验证缩小范围;
　　2.提取40对膀胱癌/癌旁组织，及5个不同恶性程度的膀胱癌细胞系中的RNA，反转录成cDNA，采用Real Time qPCR技术和FISH技术对上述筛选结果中lncRNAn346372的表达情况进行进一步组织和细胞水平的验证，同时对不同肿瘤级别中lncRNAn346372中的表达量进行t test比较分析，明确其相关性;
　　3.分别构建lncRNA-n346372 shRNA T24慢病毒及过表达5637稳转细胞株，通过CCK-8，小室，流式等实验技术，观察不同处理组相对对照组细胞功能变化情况;
　　4.在高通量测序发现的众多差异表达lncRNA及mRNA的基础上，通过生物信息学的相关性分析，预测可能与lncRNA-n346372相关的mRNA分子，进一步通过RealTime qPCR，免疫组化，Weston Blot等技术验证两者在组织和细胞表达水平的相关性，为后续功能相关性以及调控机制研究提供前提依据。
　　结果:
　　1.按照上述策略，共筛选出32条log2FoldChange＞2的lncRNAs，其中差异倍数＞3的lncRNAs共9条，lncRNA-n346372 T/N的差异倍数最高，为3.96倍;Tumor组的相对表达量平均值为4.29，Normal组为0.20;
　　2.40对组织中有18对膀胱癌组织大于癌旁组织，肿瘤组的表达量显著高于对照组(P＜0.05)，并在FISH实验中得以证实。在高级别肿瘤组织中的表达高于低级别肿瘤组织(P＜0.05)。在T24(高侵袭性)膀胱癌细胞株的表达量显著高于5637（低侵袭性）膀胱癌细胞系;
　　3.成功构建干扰/过表达稳转膀胱癌细胞株，干扰T24膀胱癌细胞内的lncRNA-n346372表达后后，其增殖能力、迁移及侵袭能力受到抑制，而过表达后细胞增殖、迁移及侵袭能力显著增强。
　　4.生物信息学相关性分析显示lncRNA-n346372与细胞周期蛋白Cyclin B1具有显著相关性(P＜0.05)，相关系数r=0.76。并在组织核酸水平的验证中得以证实，而且免疫组化、Weston Blot实验发现Cyclin B1在膀胱癌组织中表达水平高于癌旁组织。干扰lncRNA-n346372的细胞株的Cyclin B1的表达量显著低于对照组。
　　结论:
　　1.LncRNA-n346372在膀胱癌组织的表达量显著高于癌旁组织，病理级别越高lncRNA-n346372的表达量越高，与恶性表型存在显著相关性。
　　2.LncRNA-n346372参与膀胱癌细胞的增殖、迁移及侵袭等功能
　　3.LncRNA-n346372与mRNA Cyclin B1在表达水平上存在相关性，lncRNA-n346372可能通过靶向调节mRNA Cyclin B1表达影响膀胱癌细胞的功能。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

参考文献

第一部分 膀胱癌及癌旁组织中显著稳定差异表达lncRNA分子的筛选与验证

一、材料与方法

二、研究结果

三、讨论

参考文献

第二部分 探究lncRNA-n346372对膀胱癌细胞生物学行为的影响

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨论

参考文献

第三部分 生物信息学分析预测lncRNA-n346372相关mRNA及所涉及的分子机制

一、材料与方法

二、研究结果

三、讨论

参考文献

全文总结

文献综述 长链非编码RNA—膀胱癌研究的新热点

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致谢