核酸适配体A10-3.2介导前列腺癌靶向纳米给药系统的构建及其诊疗作用研究

摘要

前列腺癌是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤，每年全世界新发前列腺癌病例达1400万人次。前列腺癌的早期发病与前列腺良性增生不易区分，缺乏特异性症状，因此，有效的早期诊断和及时给予合理的靶向治疗，对前列腺癌患者提高生活质量和延长生存期至关重要。前列腺特异性膜抗原（PSMA）高表达于前列腺癌上皮细胞，核酸适配体A10-3.2能够与其特异性结合，可用作前列腺癌早期诊断与靶向治疗的特异性配体。为此，本课题开展二部分研究，第一部分以多西他赛（DTX）为化疗药物，构建A10-3.2修饰的载多西他赛PLGA纳米粒，研究其对前列腺癌的靶向治疗作用；第二部分分别以液态氟碳（PFOB）和多壁碳纳米管（MWCNT）为超声造影剂，构建A10-3.2修饰的载液态氟碳PLGA纳米粒和多壁碳纳米管，研究它们的超声造影增强作用。通过本课题研究，为前列腺癌的靶向治疗与早期诊断提供新的靶向药物和超声造影试剂。本文主要分为以下几个部分: 第一部分:核酸适配体A10-3.2修饰载多西他赛PLGA纳米粒的构建及其抗前列腺癌的靶向治疗作用 本部分研究内容包括纳米载体材料合成和纳米粒制备、体外评价和入胞机制、体内药效、药动学及组织分布研究等。 首先以PLGA-COOH和NH2-PEG-COOH为原料合成纳米载体材料PLGA-b-PEG-COOH。采用TLC和1H NMR对合成的载体进行结构鉴定和表征，结果表明载体材料合成成功。采用单因素试验考察药物量、油酸钠量和有机相与水相体积比(O/W)等处方因素对纳米粒粒径和PDI的影响，获得最佳处方为：DTX15mg、PLGA-b-PEG-COOH100mg、油酸钠50mg。采用溶剂分散法使合成的聚合物PLGA-b-PEG-COOH和油酸钠自组装形成纳米粒，在NHS/EDC的作用下，将适配体A10-3.2与PLGA-b-PEG-COOH连接，制备成功A10-3.2修饰的载多西他赛聚合物纳米粒DTX-apt-NPs。结果表明DTX-apt-NPs的粒径和电势与普通纳米粒相比只是略微增加，但DTX-apt-NPs的粒径更加均匀，包封率达到97.62%，载药量达到8.91%，体外药物释放拟合曲线方程为y=82.88467×(1+exp(-0.03684(x+0.67564)))，R2=0.9932，符合Weibull分布。 应用PSMA阳性表达的LNCaP细胞进行体外抗肿瘤活性评价与入胞机制研究。MTT实验表明空白载体无明显的细胞毒性，但DTX-apt-NPs在各个浓度与时间点下对LNCaP细胞的生长抑制作用均高于DTX注射液和DTX-NPs，表明适配体A10-3.2修饰的DTX-apt-NPs体外抗肿瘤效应显著提高。细胞摄取实验中，DTX-apt-NPs的荧光强度高于对照组，说明LNCaP细胞对DTX-apt-NPs摄取量增加；采用BCA法和HPLC法测定癌细胞对药物的摄取情况，DTX-apt-NPs的摄取量达到308.8ng/mg蛋白，是DTX-NPs摄取量的2.15倍，DTX注射液摄取量的2.75倍，说明适配体A10-3.2修饰纳米粒对DTX的摄取具有较大的促进作用。将5种不同种类抑制剂与细胞共孵育后，DTX-apt-NPs摄取量下降最显著的是高渗蔗糖溶液组和氯丙嗪组，分别下降了(66.15±12.30)%和(30.26±8.08)%，而在较低温度下细胞对DTX的摄取降低，表明DTX-apt-NPs在LNCaP细胞中的摄取机制是特异性和非特异性网格蛋白介导、耗能的主动转运过程。细胞凋亡实验中，DTX-apt-NPs对LNCaP细胞的凋亡率高于DTX注射液和DTX-NPs，说明DTX-apt-NPs可以促进细胞凋亡。细胞周期试验中，DTX-apt-NPs可以增加G2/M期的细胞数量，说明DTX-apt-NPs通过阻滞G2/M期而有效诱导LNCaP细胞凋亡和死亡。 采用LNCaP细胞构建裸小鼠皮下移植瘤模型进行药效学研究，观察给予荷瘤小鼠生理盐水、DTX注射液、DTX-NPs及DTX-apt-NPs后肿瘤重量、体积的变化。DTX-apt-NPs组肿瘤小于其他DTX制剂，说明DTX-apt-NPs的抗肿瘤作用较强。进一步进行组织切片染色观察，DTX-apt-NPs组的肿瘤组织出现新生血管破坏、肿瘤萎缩和坏死的现象，表明DTX-apt-NPs能杀伤LNCaP细胞。 应用SD大鼠进行DTX-apt-NPs的药动学和组织分布研究。血浆药物浓度-时间曲线表明DTX-NPs与DTX-apt-NPs间没有明显的药动学差异，但与DTX注射液相比，纳米制剂的DTX清除更慢，而DTX-apt-NPs的体外释放减慢，这对于提高DTX的药效有显著意义。组织分布研究表明DTX-apt-NPs在肝、脾、肾中高分布，这对于DTX应用于转移性前列腺癌晚期的治疗具有潜在价值。 本部分以核酸适配体A10-3.2为靶头分子修饰载体PLGA-b-PEG-COOH，构建成功适配体A10-3.2修饰的载多西他赛PLGA纳米粒，为多西他赛的靶向给药新剂型开发和临床前列腺癌的治疗提供了新手段。 第二部分核酸适配体A10-3.2修饰靶向纳米造影剂的制备及其超声造影增强作用研究 本部分研究内容包括A10-3.2修饰载液态氟碳PLGA纳米粒的制备与体外评价、A10-3.2修饰多壁碳纳米管的制备与体内外超声造影增强作用等。 首先以聚乳酸－羟基乙酸共聚物、N－羟基琥珀酰亚胺及聚乙二醇为原料，合成PLGA-PEG-NHS高分子聚合物。利用乳化挥发法制备包裹液态氟碳的纳米粒，与核酸适配体A10-3.2连接制备得到Apt-PLGA-PFOB。采用动态光散射法测定其电位和粒径，平均粒径198.9nm，电位-31.8mV；气相色谱－质谱法测定其包封率及载药量，包封率63.7%，载药量14.3%。利用透析法考察靶向纳米造影剂的体外释药特性，PFOB的释放拟合曲线：Y=16.52ln(t)+19.446，R2=0.9971，符合一级速率方程，即释放是按时间变化先多后少的非恒速释药，24h释药量73.2%。采用PSMA高表达的人前列腺癌细胞株LNCaP对载PFOB纳米粒的体外靶向性进行评价，结果发现PSMA高表达的LNCaP细胞对靶向纳米造影剂的摄取量比较多，且PSMA抗原-适配体介导的内吞途径在摄取过程中发挥重要作用。但在体内超声显影预实验中并未达到预期效果，这可能是由于包裹液态氟碳的纳米超声造影剂声学回声弱，特别是直径<400nm的粒子，且无法形成PFOB释放后的聚集显影功能。 鉴于Apt-PLGA-PFOB未能获得理想的造影增强效果，为此本部分进一步以多壁碳纳米管为原料，将其表面修饰PEG亲水性基团合成载体MWCNT-PEG-Apt，采用红外光谱仪、纳米粒径电位仪及透射电镜对MWCNT-PEG-Apt进行表征。采用流式细胞仪及激光共聚焦显微镜考察MWCNT-PEG-Apt细胞摄取情况，证实其可有效地被细胞所摄取，分布于细胞质中。采用CCK-8法考察MWCNT-PEG-Apt对细胞毒性影响，发现MWCNT-PEG-Apt浓度增加，细胞存活率未发生明显的改变，表明该纳米超声造影剂生物相容性和安全性较好。采用超声造影仪考察MWCNT-PEG-Apt的体外显影情况，发现其造影所需浓度低于常规造影剂，且造影效果随浓度增加而增加，表明该纳米造影剂靶向性好、毒性低、显影作用好。采用裸小鼠皮下移植瘤模型考察纳米超声造影剂的体内显影情况，发现给予造影剂后肿瘤显像明显，且MWCNT-PEG-Apt组较MWCNT-PEG组更为清晰、明亮，即适配体A10-3.2修饰后多壁碳纳米管具有肿瘤靶向性。通过肾脏考察，发现该造影剂经过肾脏代谢，体内蓄积时间短，毒性较小。 本部分成功合成了核酸适配体A10-3.2修饰的多壁碳纳米管MWCNT-PEG-Apt，体内外实验证实其具有良好的超声显影增强效果和更好的肿瘤靶向性，且体内蓄积时间短、毒性小。 总之，本课题以前列腺癌一线化疗最常用的多西他赛（DTX）为化疗药物、多壁碳纳米管（MWCNT）为超声造影剂，首次构建了核酸适配体A10-3.2修饰的载多西他赛PLGA纳米粒和多壁碳纳米管，并对它们在体内外抗前列腺癌的靶向治疗作用和超声造影的增强作用进行了深入研究，为前列腺癌的靶向诊疗提供了新的靶向药物和造影试剂。

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陈中建博士论文-20180524