利用16S rDNA序列分析鉴定油菜内生细菌研究

摘要

本试验从健康油菜植株的不同组织器官中分离到大量内生细菌，这些细菌菌落形态存在明显的差异，表明油菜组织中存在大量内生细菌，且类群丰富。分离获得的122株内生细菌，根据菌落形态可以划分为35类；利用细菌通用引物对16S核糖体DNA进行扩增，获得约1.5kb片段，分别用内切酶HaeⅢ和MspⅠ对扩增产物进行限制性酶切，产生不同的酶切图谱；根据酶切图谱聚类分析结果，所有供试菌株被归为39类，这一结果从遗传上显示油菜内生细菌类群的多样性。两种方法获得的归类结果经过比较，发现菌落特征所反映的信息量是有限的，只能作为初步的参考指标，核糖体DNA的限制性片段长度多态性分析快速、准确，可以作为油菜内尘细菌多样性分析的一种有效方法。　　通过平板对峙培养法测定122株内生细菌对十字花科黑斑病菌、油菜菌核病菌等10种植物病原真菌的抑菌作用，结果表明有22株内生细菌对一种以上的病原菌具有抑菌作用，其中5株(G5、BS5、B5、J6、LT20)抑菌谱广，抑菌作用明显；进一步测定了这5株内生细菌的无菌滤液对10种病原真菌的抑菌率，结果发现，这5株拮抗菌的发酵液对病原真菌均有不同程度的抑菌效果。本研究显示从油菜内生细菌中可筛选到拮抗作用好的菌株，并且内生细菌可产生具有抑菌活性的代谢物，可以作为对多种植物病原真菌具有抑菌活性物质的筛选资源。通过16SrDNA序列系统发育分析，5个菌株分别被鉴定为蜡状芽孢杆菌、乙酸不动杆菌、成团肠杆菌、恶臭假单胞杆菌、成团泛菌属，作为内生细菌存在于油菜体内属首次报道。　　通过16SrDNA序列系统发育分析对PCR-RFLP划分的主要类群进行了鉴定，共鉴定出内生细菌16种，分别是，分别为：蜡状芽孢杆菌、泡状枝动菌、醋酸钙不动杆菌、鲍氏不动杆菌、产吲哚金黄杆菌、燕麦食酸菌；菠萝泛菌、成团泛菌、分散泛菌以及泛菌属的2个未知种、肠杆菌属的、多食鞘氨醇杆菌、恶臭假单胞菌、黄褐假单胞菌、类黄褐假单胞菌以及假单孢菌属2个种。这一结果表明油菜内生细菌的种类非常丰富。它们都是首次在油菜中发现。其中类黄褐假单胞菌、肠杆菌属、菠萝泛菌、分散泛菌、醋酸钙不动杆菌及泡状枝动菌为首次发现的植物内生细菌种类。

目录

文摘

英文文摘

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第一章文献综述

1.1植物内生细菌的定义和研究历史

1.1.1定义

1.1.2研究历史

1.2植物内生细菌的生态学研究

1.2.1内生细菌的分离

1.2.1内生细菌的种类

1.2.2内生细菌的来源及途径

1.2.3内生细菌的种群数量

1.2.4内生细菌在植物体内的定殖检测

1.2.5内生细菌在植物体内的消长动态

1.3植物内生细菌生物学作用研究进展

1.3.1植物保护作用

1.3.2对寄主植物的促生作用

1.3.3在非豆科植物中的生物固氮作用

1.3.4作为外源基因载体

1.3.5内生细菌的有害作用

1.3.6内生细菌的应用前景

1.4油菜内生细菌的研究现状

1.5细菌1 6S RDNA基因的研究与应用

1.6论文的研究目的和研究内容

第二章油菜内生细菌的分离及16S核糖体DNA的RFLP分析

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1试验材料

2.2.2主要试剂和仪器

2.2.3内生细菌的分离方法

2.2.4分离物内生性测定

2.2.5分离物的初步归类

2.2.6细菌DNA制备

2.2.7 16S rDNA的扩增

2.2.8扩增片段的限制性酶切

2.2.9限制性酶切结果分析

2.3结果与分析

2.3.1内生细菌的分离结果

2.3.2分离物内生性测定结果

2.3.3内生分离物初步归类结果

2.3.4 16S rDNA扩增和限制性酶切结果

2.3.5限制性酶切图谱的聚类分析结果

3.4小结与讨论

图

第三章油菜内生细菌室内拮抗菌的筛选与鉴定

3.1前言

3.2材料和方法

3.2.1供试菌株

3.2.2所用培养基

3.2.3皿内平板拮抗试验

3.2.4无菌滤液抑菌作用测定

3.2.5油菜内生细菌16s rDNA的扩增

3.2.6油菜内生细菌的鉴定

3.3结果与分析

3.3.1皿内平板拮抗菌的筛选结果

3.3.2发酵液抑菌作用测定结果

3.3.4内生细菌菌株分子生物学鉴定结果

3.4小结与讨论

第四章油菜内生细菌系统发育分析

4.1前言

4.2材料和方法

4.2.1菌株来源

4.2.2油菜内生细菌16S rDNA的扩增

4.2.3油菜内生细菌的鉴定

4.3结果与分析

4.3.1 16S rDNA序列同源性比较结果

4.3.2内生细菌菌株系统发育分析结果

4.3.3油菜内生细菌的鉴定结果

4.4小结与讨论

第五章结论

参考文献

致谢

作者简介