人管家基因RNA降解规律与血痕陈旧度推断的相关性研究

摘要

目的:
　　以人离体血痕为研究对象，采用实时荧光定量PCR技术研究不同管家基因RNA随时间降解规律，建立GAPDH mRNA和18s rRNA相对含量变化与血痕陈旧度的回归方程，并试图建立标准化的RNA提取与定量检测方法，希望能最终用于法医学实践中。
　　方法:
　　1、RNA提取方法的研究：选取6个血痕样本，分别用TRIzol法和硅胶柱纯化法提取RNA，通过紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对提取的RNA定量和检测其完整性。并用TRIzol法同时提取DNA，对DNA进行STR分型检测。
　　2、GAPDH mRNA降解规律与引物位置、温度的相关性研究：在温度25℃、湿度50％环境条件下对GAPDH mRNA的4个不同位点进行不同时间点（0d、3d、6d、9d、12d）的实时荧光定量RT—PCR检测，这些位点依次分布于GAPDH mRNA的5′端～3′端，验证mRNA降解可能从5′端向3′端进行的假说；在温度20℃、湿度50％环境条件下对GAPDH mRNA的2个不同位点进行不同时间点（0d、3d、6d、9d、12d）的实时荧光定量RT—PCR检测，分析温度对GAPDH mRNA降解的影响。
　　3、不同管家基因RNA相对定量策略进行血痕陈旧度推断的进一步研究：模拟法医学真实物证现场，在室内温度是（26±2）℃、湿度大约40％即不受控条件下应用实时荧光定量PCR技术检测GAPDH mRNA和18s rRNA相对含量随时间（0d、5d、10d、15d、20d、25d、30d）的变化规律，尽可能消除实验误差，探讨其与血痕陈旧度的关系。
　　结果:
　　1、采用TRIzol法和硅胶柱纯化法提取RNA提取的总RNA纯度和得率均可满足实验要求，结果无显著性差异（p＞0.05）。对TRIzol法同时提取的DNA进行STR分型检测，可以得到理想的STR分型图谱。
　　2、在温度25℃、湿度50％环境条件下，经线性回归分析，血痕中各位点GAPDH mRNA均随时间的延长发生降解，但不同位点的mRNA降解速率不同，靠近5′端的两个位点降解速率快于靠近3′端的两个位点。在温度20℃、湿度50％环境条件下，血痕中所选两个位点GAPDH mRNA均随时间的延长发生降解，但与其在25℃环境条件下相比降解速度变慢。
　　3、在温度(26±2)℃、湿度大约40％室内环境条件下，用实时荧光定量PCR技术检测（0d、5d、10d、15d、20d、25d、30d）血痕样本中GAPDH mRNA和18s rRNA含量的变化，建立它们与血痕陈旧度的回归方程如下：GAPDH mRNA／18s rRNA：Y=-0.0002X2+0.0198X+1.6776，R2=0.9878。
　　结论:
　　1、在研究人血痕管家基因降解规律的实验中，总RNA的提取是实验成功与否的关键，采用TRIzol法和硅胶柱纯化法提取RNA提取的总RNA均可满足实验要求，但TRIzol法可以实现RNA和DNA的同步提取，基于法医学实际检案中节约检材的需要应当选用TRIzol法进行后续实验。
　　2、血痕中同一管家基因的不同位点存在降解速率的差异性，造成这种差异性的原因可能是mRNA降解是从5′端向3′端进行的。不同的环境温度对mRNA降解的影响较大，因血痕中管家基因RNA降解速度缓慢，所以设计引物时应选取靠近5′端的位点，这些位点降解速率相对稍快，可能更适于血痕陈旧度的推断。
　　3、依据不同管家基因RNA相对定量策略进行血痕陈旧度推断并进行多因素分析为此研究领域提供了一个新的思路。

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英文摘要

符号说明

前言

1、血痕理化性状随时间的变化规律

2、血痕形成时间推断技术的新进展

3、实验方法

第一章血痕总RNA提取方法评价

材料与方法

结果

讨论

结论

第二章 GAPDH mRNA降解规律与血痕陈旧度的研究

方法与结果

讨论

结论

附图

第三章不同管家基因RNA相对定量策略进行血痕陈旧度推断的研究

方法与结果

讨论

结论

附图

参考文献

综述: 血痕陈旧度检测与法医学

致谢

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