人基质金属蛋白酶2（MMP-2）类血红素结构域原核表达、复性及生物学活性验证

摘要

人基质金属蛋白酶2(HumanMatrixMetalloproteinase-2，MMP-2)类血红素结构域(Hemopexin-likeDomainofHumanMatrixMetalloproteinase2，PEX)是人基质金属蛋白酶2的C端片断，可溶型MMP的PEX部分能特异的和细胞膜上的一类αυβ3跨膜蛋白结合，使MMP固定在细胞的表面，引发MMP上的催化结构域活化并开始降解细胞基质和破坏基底膜。正常生理条件下，MMP通过降解活性为细胞的生长提供必要的空间，然而在肿瘤等一些病理情况下，MMP高水平表达，它通过促进肿瘤血管的生成而参与肿瘤的浸润和转移。MMP的C端片断PEX能竞争性的结合细胞膜上的αυβ3受体，干扰了MMP和αυβ3的结合，保护细胞间的基质不被破坏，从而抑制新生的血管生成。基于治疗肿瘤的“休眠疗法”(dormancytherapy)，人基质金属蛋白酶2(MMP-2)类血红素结构域(PEX)一直被认为是在肿瘤抑制血管生成治疗方面是一种有希望的候选药物。目前国外已经在原核和真核中表达了人基质金属蛋白酶2(MMP-2)类血红素结构域(PEX)，结果发现表达产物通过抑制新生血管的生成能显著的抑制肿瘤组织的生长和转移；国内也已经有在原核表达鸡基质蛋白酶2(MMP-2)类血红素结构域(PEX)抑制新生血管生成等的报道。 本研究利用本实验室已经构建好的人基质金属蛋白酶2(MMP-2)类血红素结构域(PEX)的原核表达载体PET-PEX诱导表达PEX，从考虑生产成本入手，通过优化诱导时IPTG的浓度，OD值，诱导时间和LB培养基的pH值，获得近40％的重组PEX蛋白表达量；PEX包涵体洗涤通过对比三个洗涤方案，发现选择复合洗涤能获得比较纯的包涵体蛋白，软件分析洗涤后的包涵体蛋白占到总蛋白的86％；同时对尿素和盐酸胍溶解的包涵体溶液采取三种不同的复性方案，计算复性率，鸡胚绒毛尿囊膜实验验证复性产物有抑制血管生成的活性。本实验通过选择简便经济的复性方案，为重组PEX蛋白商品化打下基础。 本实验主要获得以下研究结果： 1.通过优化原核表达载体PET-PEX在大肠杆菌BL21中的表达条件，确定了重组PEX最佳表达条件；确定在5L较大规模培养表达大肠杆菌BL21产生重组PEX时最佳pH为7.5时能获得最佳的相对表达量。 2.确定PEX包涵体蛋白采用复合洗涤方案能获得比较理想的洗涤效果。 3.通过对比不同的复性方案和复性成本，确定尿素溶解的包涵体采用逐渐降低尿素浓度为一种经济方便的方案。 4.得到了少许有抑制血管活性的重组PEX蛋白。

目录

文摘

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第一章文献综述1.1原核表达系统

第一章文献综述 1.2包涵体复性

第一章文献综述 1.3基质金属蛋白酶研究进展

第一章文献综述 1.4肿瘤抗血管生成疗法研究进展

第二章实验部分 2.1材料和方法

第二章实验部分 2.2实验步骤

第二章实验部分 2.3结果与分析

第二章实验部分2.4讨论

参考文献

致谢

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