人脂联素球状结构域(gAd)的原核表达、纯化及生物活性检测

摘要

目的：
　　 1、建立gAd基因原核表达体系2、基因重组gAd蛋白的表达3、基因重组gAd蛋白的纯化4、对基因重组gAd蛋白的生物活性进行检测。
　　 方法：本研究首先从健康人全血中抽提基因组DNA，从Genbank获取脂联素球状结构域的基因序列，设计引物在上游引物中加入EcoRⅠ酶切位点和起始密码，在下游引物中加入6个组氨酸，终止密码和PstⅠ酶切位点，对目的片段进行PCR扩增，把扩增产物经切胶回收、纯化后克隆入经EcoRⅠ和PstⅠ双酶切并纯化后的pBV220载体，该重组质粒命名为pBV220-gAd，转化大肠杆菌JM109，筛选出阳性菌株，提取质粒，对质粒进行双酶切鉴定后测序。酶切和测序结果正确后对JM109/pBV220/gad表达系统进行诱导表达，该系统可在适当的培养和诱导条件下4-5h内表达gad蛋白占菌体总蛋白的28％，表达的量较高，免疫学鉴定结果表明该异源重组蛋白具有His-tag抗原活性。gad蛋白纯化方法采用固定金属亲和层析(IMAC)的方法，使用TALON Metal Affinity后，采用咪唑梯度洗脱的方法对gad蛋白进行了纯化，免疫学鉴定结果表明纯化后的重组蛋白具有His-tag抗原活性。纯化后的gAd蛋白经复性腹腔注射于糖尿病鼠模型，与对照组比较血糖下降显著，证明重组gad蛋白具有生物学活性。
　　 结果：从健康人全血中提取出可用于PCR扩增的基因组DNA，以提取获得的基因组DNA为模板，进行PCR，扩增出与理论的gAd基因片段414bp大小基本相符的gAd基因片段，与经EcoRⅠ和PstⅠ双酶切并纯化后的pBV220载体连接，构建了pBV220-gAd质粒表达载体，经双酶切鉴定目的片段与理论大小一致，经测序证实该序列与基因库中报道的完全一致，说明成功构建了pBV220-gAd表达载体。
　　 JM109/pBV220/gad表达系统属于PRPL串联双启动子的高效原核基因表达系统，实验结果证实pBV220-gAd/JM109在30℃培养至对数生长期时菌密度A600为0.6左右进行诱导表达，诱导5h，目的蛋白获得较高的表达量，其表达量占菌体总蛋白总量的28％，免疫学鉴定结果表明该异源重组蛋白具有His-tag抗原活性。固定金属亲和层析(IMAC)是近年来发展起来的一种亲和方法，其固定相基质上鳌合了一些金属离子，如Co2+、Ni2+、Fe3+等，其配基为侧链含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽，特别是肽序列中含有His-X-X-X-His的结构最易结合到金属离子亲和柱上，纯化效果较好。本课题中，的设计是基于其N端设计有6个His组成的His标签。His的咪唑环作为电子供体容易与固定的金属离子形成配位键，含有连续His残基序列的多肽可在IMAC基质中有效保留。基质材料洗涤之后可通过添加游离咪唑洗脱含多聚His的多肽。本实验用TALONMetalAffinityResin纯化后获得gAd蛋白经SDS-PAGE显示单一条带，表明pBV220-gAd/JM109菌体蛋白经TALONMetalAffinityResin纯化后获得gAd融合蛋白的纯品，免疫学鉴定结果表明纯化后的重组蛋白具有His-tag抗原活性。
　　 通过对实验组和对照组糖尿病大鼠重组gAd蛋白治疗前和治疗后禁食8h后空腹血糖的比较实验，证实重组gad蛋白具有降低糖尿病大鼠血糖的生物学作用。
　　 结论：成功构建了pBV220-gAd原核表达载体；经诱导获得目的蛋白高表达，经纯化获得了较纯的gAd蛋白，经动物实验检测具有降低血糖的生物学活性。本研究为进一步将gAd蛋白开发成新型抗糖尿病药物奠定了实验技术基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录,英文缩略词表

声明

前言

第一章 gAd蛋白的原核表达体系的建立

第二章 基因重组gAd蛋白的表达

第三章 基因重组gAd蛋白的纯化

第四章 gAd蛋白生物学活性的测定

研究结论

参考文献

综述　脂联素的研究进展

个人简介、学习经历及临应及科研经历

致谢