人CD9基因真核表达载体的构建及蛋白表达检测

摘要

CD9蛋白广泛分布于血小板、前B细胞、单核细胞等造血细胞中，CD9还分布于骨髓细胞、脑细胞和肌肉细胞中，另外CD9还普遍在不同组织的干细胞表面表达，在卵母细胞中也有CD9表达。CD9相对分子质量为24KD。分子中有4个疏水区，往返4次穿过细胞膜，与其它多种同源性膜蛋白共同组成“4次跨膜蛋白”(Tetraspanin)超家族。CD9被证明和细胞支持、细胞黏附、细胞运动、细胞增殖、细胞融合及肿瘤细胞的转移等有关，另外CD9也是精卵质膜相互作用中一种重要的蛋白。因此本实验拟通过构建CD9真核表达载体。利用逆转录病毒转染效率高，外源基因表达稳定等优点，在哺乳动物细胞中表达人CD9蛋白，为对CD9的进一步研究创造条件。 本实验通过RT-PCR技术对人CD9基因的cDNA进行了扩增、克隆、序列测定和分析，再将cDNA插入逆转录病毒载体，获得重组质粒载体，经293GP包装细胞包装成假病毒后转染目的细胞SP2/0，取得如下结果： 1.RT-PCR方法扩增人CD9cDNA 将人ES细胞在DMEM培养基培养至细胞数达到107左右，Trizol提取细胞总RNA，紫外定量后，取适量进行RT-PCR，PCR产物琼脂糖凝胶电泳，结果显示PCR获得了目的大小片段。 2.CD9cDNA序列测定及分析 PCR产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后与pGEM-T载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，从转化的平板上挑取克隆，质粒提取试剂盒提取质粒，鉴定后测序。测序结果与NCBI上登录的人CD9基因序列完全一致。 3.重组逆转录病毒质粒载体的构建 T-CD9重组质粒经双酶切，回收CD9cDNA片段，逆转录病毒质粒载体pBabepuro也用双酶切使之线性化，将线性化的pBabepuro与CD9片段用T4DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，从转化的平板上挑取克隆，酶切鉴定，证明逆转录病毒质粒载体pBabepur-CD9构建成功。 4.重组逆转录病毒的包装 用DMEM培养基培养293GP细胞达60﹪-70﹪融合时，将重组质粒pBabepuro及pVSVG用磷酸钙转染法转入293GP包装细胞中，转染48h后，收集含假病毒颗粒的培养上清液转染SP2/0细胞，嘌呤霉素筛选阳性细胞。 5.人CD9蛋白在重组细胞中的表达 分别采用RT-PCR法、WESTERN杂交法、流式细胞仪法检测重组细胞中CD9表达情况，经检测CD9基因在SP2/0重组细胞中正常表达。

目录

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文献综述 第一章基因表达及假病毒转染的研究进展

1.1目的基因的获得

1.1.1从基因组中直接分离

1.1.2通过RNA合成cDNA

1.1.3基因的化学合成

1.2基因的原核表达系统

1.2.1原核生物基因表达学的特点

1.2.2外源基因在原核细胞表达的重要调控元件

1.2.3大肠杆菌表达系统

1.2.4芽胞杆菌系统

1.3基因的真核表达系统

1.3.1酵母表达系统

1.3.2 P.Pastoris表达系统

1.3.3哺乳动物细胞表达系统

1.3.4昆虫细胞表达系统

1.4假病毒感染哺乳动物细胞

1.4.1假型病毒的概念

1.4.2假型病毒的制备

1.4.3假型病毒的应用

文献综述 第二章CD9研究进展

2.1 CD9组织器官的分布

2.2 CD9的染色体定位

2.3 CD9的结构

2.4 CD9的功能

2.5 CD9在精-卵结合中的作用

实验研究第三章人CD9基因cDNA的克隆与真核表达载体的构建

3.1材料方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果

3.2.1总RNA提取

3.2.2 CD9基因cDNA的扩增

3.2.3重组T载体的构建，测序及序列分析

3.2.4重组真核表达载体的构建

3.3讨论

3.4小结

实验研究 第四章假病毒的包装、感染及重组细胞的筛选

4.1材料方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2结果

4.2.1 pBabe puro-CD9,pVsvg质粒的大提

4.2.2重组细胞筛选

4.2.3人CD9蛋白在重组细胞中表达的检测

4.3讨论

4.3.1关于重组细胞的构建

4.3.2关于重组细胞中外源蛋白表达的检测

4.4小结

研究结论

参考文献

附录

致谢

作者简介