生防细菌菌株GXG-2-2的筛选、鉴定及其产生的抑菌活性物质的初步研究

摘要

本试验旨在从不同的枯草样品中分离筛选出对小麦全蚀病和几种常见的植物病原真菌都具有较好颉颃作用的生防芽孢杆菌，并对颉颃效果较好的生防菌株进行鉴定和发酵条件优化；对其产生的抑菌活性物质进行初步的研究。 (1)本试验首次从采自陕西杨凌的5份枯草样品中分离得到了253株细菌，通过平板对峙法、单胞分离和液体发酵试验、盆栽复筛试验得到了一株对小麦全蚀病菌具有强烈颉颃作用的新菌株GXG-2-2。 (2)对GXG-2-2菌株发酵条件进行了优化，确定该菌株的最佳培养时间是48h，最适生长温度28℃，且培养基初始pH为7.0，装液量100 mL，摇瓶转速为180 r/min时，细菌菌量、蛋白量和抑菌效果都达到最佳。 (3)室内盆栽测定发现，枯草芽孢杆菌GXG-2-2对小麦全蚀病都有明显的抑制作用，而且对根长、株高、根干重、鲜重、地上部干重和鲜重都有明显的增加。枯草芽孢杆菌GXG-2-2菌悬液用土壤浇灌法施用防治小麦全蚀病比种子包衣、浸种防治效果明显，在播种同时施用比24h以后和播种7d后效果好，高浓度比低浓度防治效果明显。 (4)通过皿内生物颉颃活性测定，研究了GXG-2-2菌株的抗菌蛋白粗提液的抑菌谱。结果表明，GXG-2-2菌株具有较广的抑菌谱，对20种病原真菌和3种供试细菌有较好的抑制效果。其中对小麦纹枯病菌和大白菜软腐病菌抑制能力最强。 (5)按照传统鉴定方法，根据菌株GXG-2-2的培养性状、形态特征、染色反应及一些生理生化反应的试验结果，并参照相关文献，初步判定其为芽孢杆菌属的枯草芽孢(Bacillussubtilis)。 (6)粗蛋白性质研究结果发现：当达到80％饱和度的(NH<,4>)<,2>SO<,4>沉淀时，抗菌蛋白的量达到最大值，抑菌活性也达到最大。粗蛋白在中性和碱性条件下都有活性，pH为7.6时，活性最高。粗蛋白对温度、紫外线和蛋白酶K不敏感，对氯仿部分敏感。用PAGE已经检测到了具有活性的蛋白条带。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1微生物农药研究与应用现状

1.1.1细菌杀菌剂

1.1.2真菌杀菌剂

1.1.3生防放线菌

1.1.4微生物除草剂

1.1.5遗传工程杀菌剂

1.2细菌应用于植物病害生物防治的历史及现状

1.2.1生防细菌应用的主要种类

1.2.2生防细菌防治植物病害的主要机制

1.2.3生防细菌的应用途径

1.2.4细菌作为生防因子的优势及存在的问题

1.3枯草芽孢杆菌在生物防治中的应用

1.3.1枯草芽孢杆菌概述

1.3.2枯草芽孢杆菌的抑菌机制

1.3.3枯草芽孢杆菌应用于植物病害防治的研究现状

1.3.4枯草芽孢杆菌在病害防治应用中存在的问题及措施

1.4论文的设计思路

第二章材料与方法

2.1材料

2.1.1供试材料

2.1.2供试病原菌

2.1.3试验用小麦品种

2.1.4培养基

2.1.5主要仪器及试剂

2.2方法

2.2.1颉颃细菌菌株的分离、筛选及纯化培养

2.2.2菌株发酵条件的优化

2.2.3颉颃细菌GXG-2-2对小麦全蚀病菌的生防作用

2.2.4优良菌株的初步鉴定

2.2.5 GXG-2-2菌株抑菌蛋白的产生条件

第三章结果与分析

3.1颉颃细菌的分离结果

3.2颉颃细菌对病原真菌菌落生长的抑制作用

3.3生防芽孢杆菌的纯化培养

3.4 GXG-2-2菌株发酵条件优化实验结果

3.4.1培养时间对抗菌蛋白活性的影响

3.4.2培养温度对抗菌蛋白抗菌活性的影响

3.4.3培养基pH值对抗菌蛋白抗菌活性的影响

3.4.4装液量对抗菌蛋白抗菌活性的影响

3.4.5摇瓶转速对菌株生长及抗菌活性影响

3.5 GXG-2-2菌株抑菌谱测定实验结果

3.6 GXG-2-2菌株不同处理对小麦全蚀病病害发生情况的影响

3.7生防芽孢杆菌优良菌株的初步鉴定结果

3.7.1培养特征，形态观察

3.7.2生理生化特征实验结果

3.8枯草芽孢杆菌GXG-2-2菌株分泌的胞外抗菌蛋白性质的初步研究

3.8.1最佳硫酸铵饱和浓度的确定

3.8.2抗菌粗蛋白质pH稳定性测定结果

3.8.3温度影响抗菌粗蛋白质抑菌活性的测定

3.8.4氯仿、紫外线和蛋白酶K对粗蛋白活性的影响结果

3.8.5抗菌蛋白吸光值测定

3.8.6抗菌蛋白的非变性PAGE

第四章结论与讨论

4.1结论

4.2讨论

4.2.1关于生防细菌筛选方法的讨论

4.2.2关于颉颃细菌鉴定的讨论

4.2.3关于枯草芽孢杆菌在植物病害防治中的应用

4.2.4关于微生物抗菌蛋白作用机理的讨论

参考文献

附录

致谢

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