猪PGC-1α、线粒体相关基因组织表达及Leptin对PGC-1α、UCPs mRNA表达的影响

摘要

线粒体是细胞内重要的亚细胞器，普遍存在于真核细胞中，其通过呼吸作用将糖、蛋白、脂类等生物大分子物质氧化分解，释放ATP，为机体提供能量。目前研究表明，线粒体不仅与能量代谢密切相关，而且其也是影响肉质嫩度及风味的一个重要因素没，本研究以猪为实验动物， (1)利用RT-PCR方法分析线粒体相关基因PGC-1α、UCP2、UCP3、Cyt-c、CPT-Ⅰ组织差异表达特点： (2)建立了猪骨骼肌卫星细胞的分离培养体系； (3)研究外源Leptin对猪成肌细胞中PGC-1α、UCPs mRNA表达的影响。得出以下结论： 1.PGC-1α基因进行组织分布研究发现：心脏、肝脏、肌肉、肺脏、肾脏、脾脏、皮下脂肪和内脏脂肪中均有的PGC-1α mRNA表达，其中心脏、肝脏、肌肉的表达丰度最高， UCP2基因在、肌肉、皮下脂肪、肾脏、脾脏、内脏脂肪中均有表达，在心脏、肺中没有检测到表达，其中肾脏表达丰度最高，在肌肉中次之，肝脏中的表达量最低。而内脏脂肪和皮下脂肪中UCP2基因mRNA表达丰度差异不显著。UCP3基因在肌肉、皮下脂肪、内脏脂肪中均有表达，在其他几个组织中均没有检测到表达，肌肉、皮下脂肪、内脏脂肪UCP3基因mRNA表达丰度差异不显著。Cyt-c基因在心脏、肝脏、肌肉、皮下脂肪、肾脏、脾脏、内脏脂肪、脾脏和肺中均有表达，其中心脏中表达最高，肝脏、肌肉表达次之。CPT-Ⅰ基因mRNA在心脏、肝脏、肌肉、皮下脂肪、肾脏、脾脏、内脏脂肪、脾脏和肺中均有表达，其中肝脏中表达最高，心脏、肾脏、脾脏镖达次之，而皮下脂肪的表达量高于肌肉(P<0.05)。 2用链酶蛋白酶、胰酶、胶原酶分别消化骨骼肌组织块，结果表明，链酶蛋白酶消化所获得的肌卫星细胞数显著高于胰酶和胶原酶。在一定的消化时间内，胶原酶消化的效果较差，消化物中含大量的肌束，所获得肌卫星细胞数量很少。三种酶消化所得细胞活率无显著差异。用Desmin抗体及ABC染液进行间接免疫酶染色，RT-PCR方法检测MyoG和MyoD的表达，结果显示链酶蛋白酶消化所得肌卫星细胞95％呈阳性反应，培养7天后MyoG和MyoD均有表达，说明分离得到是肌卫星细胞。 3半定量RT-PCR分析结果表明，30和100 nmol/L的Leptin均可促进PGC-1a转录，100 nmol/L Leptin处理12 h后可促进PGC-1αmRNA表达：处理24 h后，PGC-1 α mRNA水平显著高于对照组(p<0.05)。30 nmol/L处理24 h后可提高PGC-1α mRNA水平，但其促进效果明显低于100 nmol/L处理组(p<0.05)。半定量RT-PCR分析结果表明，30 nmol/L Leptin可明显提高成肌细胞中UCP2mRNA的表达，处理12和24 h后UCP2mRNA水平显著高于对照组，且作用24 h促进效果明显优于12 h处理效果(p<0.05)，100 nmol/L Leptin提高成肌细胞中UCP2mRNA的表达，处理12和24 h后UCP2mRNA水平显著高于对照组，但作用效果显著低于12和24 h后30 nmol/L Leptin作用效果(p<0.05)。30和100 nmol/L Leptin在时间上和剂量上，均不影响UCP3mRNA水平表达水平(p<0.05)。综上所述，线粒体相关基因表达存在明显的组织差异性，PGC-1a在富含线粒体的组织中表达较高，表明其与线粒体发育存在明显相关。其它基因根据组织能量需求及代谢特点不同而表达有所差异.外源添加不同浓度的Leptin显著影响PGC-1α和UCP表达，提示leptin可通过调控线粒体而影响机体能量代谢。以上结论可为动物肌肉发育和控制人类相关代谢疾病的研究提供理论参考。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章PGC-1α的研究进展

1.1PGC-1α的研究进展

1.1.1 PGC-1α的结构特点

1.1.2生物学特性

1.1.3 PGC-1α功能研究

1.1.4 PGC-1α作用机制

1.2线粒体相关基因的研究进展

1.2.1 UCPs的研究进展

1.2.2细胞色素c(Cyt-C)与肉碱棕榈酰转移酶(CPT-Ⅰ)

1.3 PGC-1α与线粒体相关基因的关系

1.3.1 PGC-1α刺激线粒体的增生

1.3.2 PGC-1α影响适应性产热

1.3.3 PGC-1α与脂肪酸的β氧化

第二章肌卫星细胞生物学特性和体外培养技术的研究

2.1肌卫星细胞生物学特性

2.1.1肌卫星细胞的起源

2.1.2肌卫星细胞多向分化潜能

2.1.3肌卫星细胞的激活及调节因素

2.2肌卫星细胞体外培养技术的研究

实验研究前言

实验研究第三章猪PGC-1α、线粒体相关基因组织表达研究

3.1材料和方法

3.1.1实验材料

3.1.2方法

3.1.3 PCR扩增

3.1.4凝胶电泳及凝胶成像和定量分析

3.1.5数据分析

3.2结果与分析

3.2.1各组织提取的RNA

3.2.2各组织PGC-1α及其β-actin基因的扩增条带

3.2.3各组织PGC-1α基因mRNA表达丰度的差异性检验

3.2.4各组织UCP2及其β-actin基因的扩增条带

3.2.5各组织UCP2基因mRNA表达丰度的差异性检验

3.2.6各组织UCP3及其β-actin基因的扩增条带

3.2.7各组织UCP3基因mRNA表达丰度的差异性检验

3.2.8各组织Cyt-c及β-actin基因的扩增条带

3.2.9各组织Cyt-c基因mRNA表达丰度的差异性检验

3.2.10各组织CPT-Ⅰ及β-actin基因的扩增条带

3.2.11各组织CPT-Ⅰ基因mRNA表达丰度的差异性检验

3.3讨论

实验研究第四章猪骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定

4.1材料和方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2结果

4.2.1原代培养肌卫星细胞动态观察

4.2.2三种酶消化法比较

4.2.3生长曲线绘制

4.2.4肌卫星细胞鉴定

4.2.5细胞提取RNA的完整性

4.2.6 RT-PCR检测成肌细胞标志基因表达

4.3讨论

实验研究第五章Leptin对猪成肌细胞中PGC-1a和UCPS mRNA表达的影响

5.1材料和方法

5.1.1材料

5.1.2方法

5.2结果与分析

5.2.1成肌细胞培养的形态学观察

5.2.2成肌细胞提取RNA的完整性

5.2.3 Leptin对PGC-1a表达的影响

5.2.4 Leptin对UCP2、UCP3表达的影响

5.3讨论

结论

参考文献

附录

致谢

作者简介