不同树龄葡萄园酵母菌的研究

摘要

葡萄酒酿造是一个复杂的生物转化过程，其中由酵母菌主导的酒精发酵是葡萄酒生产最重要的阶段之一。酵母菌的生物多样性及其群体组成对葡萄酒的感观质量具有重要影响。 葡萄酒相关酵母菌受诸多因素的影响，对于这些因素的研究，尤其是葡萄园年龄对葡萄酒相关酵母菌的具体影响，国内外在此方面的研究未有报道。所以对不同树龄葡萄园酵母菌的研究就更值得我们去探索。 采集河北昌黎产区当地典型品种的不同树龄(葡萄树龄受当地条件的限制)葡萄酒相关酵母，利用WL培养基培养对采集的菌株进行初步分类，在此基础上选取具有代表性酵母菌的纯培养，通过5.8S-ITS区的PCR/RFLP分析对所选菌株进行鉴定，确定不同树龄葡萄园的酵母菌种组成，并对差异进行分析。主要是基于给酵母菌所提供的主要营养成分进行分析。 通过本试验得到以下结果： 1.利用WL营养培养基培养进行聚类分析，将采集于不同树龄西拉葡萄园的280株葡萄酒相关酵母菌分为7个培养类型，同样将采集于不同树龄赤霞株葡萄园的268株葡萄酒相关酵母菌分为7个培养类型。 2.采用5.8S-ITS区序列分析，结果表明西拉不同树龄(2年生、3年生、5年生)葡萄园酵母菌种有7种，分别是：Issatchenkia terricola(陆生依萨酵母)、Cryptococcus flavescens(浅黄隐球酵母)、Hanseniaspora uvarum(葡萄汁有孢汉逊酵母)、Saccharomyces cerevisiae(酿酒酵母)、Cryptococcus kuetzingii(隐球酵母)、Rhodotorula acuta(红酵母)、Pichia kluyveri(克鲁维毕赤酵母)；赤霞株不同树龄(2年生、7年生、17年生)葡萄园酵母菌种有7种，分别是：Candida．soborsa(假丝酵母)、Cryptococcus flavescens(浅黄隐球酵母)、Hanseniaspora uvarum(葡萄汁有孢汉逊酵母)、Saccharomvces cerevisiae(酿酒酵母)、Cryptococcus kuetzingii(隐球酵母)、Rhodotorula acuta(红酵母)、Pichiakluyveri(克鲁维毕赤酵母)。 同品种不同树龄葡萄园酵母菌群，随着树龄的增加有所变化。如果树龄问隔相差不大，酵母菌种类相同，其差异主要表现在酵母菌的数量上；如果树龄间隔相差较大，其差异不仅表现在酵母菌的数量上，而且酵母菌种类也有一定的差异，但差异不显著。各葡萄园的优势种均为Saccharomyces cerevisiae(酿酒酵母)、Hanseniaspora uvarum(葡萄汁有孢汉逊酵母)并且随着树龄的增加，Saccharomyces cerevisiae(酿酒酵母)所占据的主导地位加强，Hanseniaspora uvarum(葡萄汁有孢汉逊酵母)有所减弱。 3.实验结果表明，同品种不同树龄葡萄园酵母菌自然发酵过程中酵母菌是有变化的，表现在酵母菌种类和数量上。其中各树龄西拉葡萄自然发酵中总的酵母菌种类有：Issatchenkia terricola(陆生依萨酵母)、Cryptococcus．flavescens(浅黄隐球酵母)、Hanseniaspora uvarum(葡萄汁有孢汉逊酵母)、Saccharomyces cerevisiae(酿酒酵母)、Pichia kluyveri(克鲁维毕赤酵母)，随着树龄的增加酵母菌种类和数量都有变化；各树龄赤霞株葡萄自然发酵中总的酵母菌种类有：Candida．soborsa(假丝酵母)、Hanseniaspora uvarum(葡萄汁有孢汉逊酵母)、Saccharomyces cerevisiae(酿酒酵母)、Pichia klurveri(克鲁维毕赤酵母)，同样随着树龄的增加酵母菌种类和数量都有变化。 4、不同树龄葡萄果皮酵母种类没有差异，其差异表现在酵母菌种的数量上。西拉和赤霞株葡萄果皮上酵母菌群也相同，分别是Cryptococcus flavescens(浅黄隐球酵母)、Pichia kluyveri(克鲁维毕赤酵母)、Cryptococcus kuetzingii(隐球酵母)，优势菌种相同均为Cryptococcus flavescens(浅黄隐球酵母)，随着树龄的增加其菌种数量是有变化的；不同树龄葡萄园土壤中酵母种类也没有差异，其差异表现在酵母菌种的数量上。西拉和赤霞株葡萄园土壤中酵母菌群也相同分别是Cryptococcus flavescens(浅黄隐球酵母)、Rhodotorula acuta(红酵母)、Cryptococcus kuetzingii(隐球酵母)，优势菌种均为Cryptococcus kuetzingii(隐球酵母)，随着树龄的增加其菌种数量是有变化的。 5.不同树龄葡萄园葡萄果汁中的主要营养成分(总糖、总氮、总酸、pH值、氨基酸)不相同，差异是否显著与葡萄树龄间隔相关。土壤中的主要成分(有机质、全氮、PH值)没有很大变化。 通过本试验，对不同树龄葡萄园酵母菌有了具体的研究，得到了葡萄树龄与葡萄酒相关酵母菌的关系，其结果表明，用树龄较高的葡萄来发酵，很有可能会加速发酵的启动，缩短发酵周期，同时也有利于性状优良的野生酿酒酵母菌株的筛选；为葡萄酒生产提供科学依据。

目录

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第一章文献综述

1.1葡萄酒相关酵母菌概况

1.1.1葡萄酒相关酵母菌的发现

1.1.2葡萄酒相关酵母菌的定义、种类

1.2葡萄园酵母菌的生态学

1.2.1葡萄园酵母菌的分布

1.2.2葡萄园酵母菌的多样性

1.2.3影响葡萄园酵母菌种类和数量的因素

1.3葡萄酒相关酵母菌在葡萄酒生产中的作用

1.4葡萄酒相关酵母的鉴定

1.4.1传统的分类鉴定

1.4.2分子生物学方法在鉴定中的应用

1.5葡萄酒相关酵母菌对营养的需求

1.5.1酵母菌的营养概况

1.5.2酵母菌营养物质的种类

1.6本研究的目的与意义

第二章材料和方法

2.1菌种采集

2.1.1菌种分离采集地点

2.1.2分离培养基

2.1.3分离方法：稀释平板涂布法

2.1.4自然发酵过程中酵母菌的分离

2.1.5葡萄浆果表面酵母菌的分离

2.1.6土壤中酵母菌的分离

2.1.7菌种保藏：甘油低温冷冻保藏法

2.2酵母菌的形态学鉴定

2.2.1 WL培养基

2.2.2 WL培养基培养初步分类

2.3所选酵母菌的分子生物学鉴定

2.3.1酵母菌总DNA的提取

2.3.2 5.8S-ITS区域的PCR扩增

2.3.3 PCR产物的RFLP分析

2.4不同树龄葡萄果实主要营养成分的测定

2.5不同树龄葡萄园土壤主要成分的测定

2.6主要仪器和设备

第三章结果与分析

3.1试验菌种的初步分类

3.1.1不同树龄西拉葡萄园酵母菌种的初步分类

3.1.2不同树龄赤霞株葡萄园酵母菌种的初步分类

3.2所选菌株的分子生物学鉴定

3.2.1西拉葡萄园酵母菌株的5.SS-ITS区RFLP分析

3.2.2聚类分析

3.2.3赤霞珠葡萄园酵母菌株的5.SS-ITS区RFLP分析

3.2.4聚类分析

3.3自然发酵、果皮及葡萄园土壤中酵母菌群的分析

3.3.1不同树龄西拉葡萄自然发酵过程中酵母菌群的分析

3.3.2不同树龄赤霞珠葡萄自然发酵过程中酵母菌群的分析

3.3.3不同树龄西拉葡萄果皮及葡萄园土壤中酵母菌群的分析

3.3.4不同树龄赤霞珠葡萄果皮及葡萄园土壤中酵母菌群的分析

3.4葡萄园总酵母菌群的生态学分析

3.4.1不同树龄西拉葡萄园总酵母菌群的生态学分析

3.4.2不同树龄赤霞珠葡萄园总酵母菌群的生态学分析

3.5不同树龄葡萄园葡萄果实及土壤中主要营养成份的分析

3.5.1不同树龄葡萄果实中主要营养成分的分析

3.5.2不同树龄葡萄园土壤中主要成分的分析

第四章讨论

4.1 5.8S-ITS区RFLP在葡萄酒相关酵母鉴定中的应用

4.2不同树龄葡萄园酵母菌群特点

4.3不同树龄葡萄果实与葡萄园土壤中主要营养成分的特点

第五章结论

参考文献

致谢

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