黄牛孤雌胚胎体外培养体系的优化及体细胞核移植胚构建初探

摘要

本试验通过在成熟基础液中添加不同浓度的HMG(人尿促性素)和ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒酸钠)以观察对黄牛卵母细胞体外成熟率的影响，分析了卵巢运输过程中保存温度和时间及卵巢所处性周期阶段与黄牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的关系；探讨了培养过程中培养微滴大小、每次换液量、添加血清是否灭活及血清添加时间和添加浓度对黄牛孤雌胚胎体外发育潜力的影响，并比较了4种培养液的培养效果；研究了有无颗粒细胞单层、不同类型及种属的颗粒细胞单层、颗粒细胞单层体外培养时间及在不同时间更换培养单层对黄牛孤雌胚胎体外发育的影响，旨在优化黄牛孤雌胚胎体外培养体系；对以黄牛颗粒细胞为核供体，去核卵母细胞为核受体构建核移植胚胎进行了初步探讨。结果如下： 1.在成熟基础液中添加0.05IU/mL和0.1IU/mL的HMG卵母细胞成熟率极显著高于0.025 IU/mL组(71.26％,74.30％/31.52％；P<0.01)；而添加10μL/mL ITS则对卵母细胞体外成熟率和卵裂率影响不大(71.52％/69.47％；84.96％/82.42％)，但可以提高卵母细胞孤雌激活后的囊胚发育率(41.67％/32.0％)；就卵母细胞成熟率和囊胚率而言，卵巢置于20～29℃保存(61.11％/33.33％)与10～19℃(41.18％/17.65％)和30～39℃保存(71.34％/41.84％)无显著差异(P>0.05)，但后两组之间差异显著(P<0.05)；30～39℃中保存1～3h抽出的卵母细胞较保存8～10h抽出的卵母细胞有较高的成熟率、卵裂率和囊胚发育率(68.57％/32.29％,86.11％/25.81％,40.32％/0；P<0.05)；黄体期无黄体组与有黄体组均低于卵泡期卵母细胞的体外成熟率、卵裂率和囊胚发育率，但差异不显著(P>0.05)。 2.与50μL组和200μL组相比，黄牛孤雌胚胎体外培养在100μL微滴中可以获得较高的囊胚率，3组之间无显著差异(43.20％/31.34％/38.82％)(P>0.05)；每次更换培养液体积的1/2组比每次更换1/4组和3/4组更有利于黄牛孤雌胚胎的体外发育，就囊胚率而言有显著差异(41.84％/26.39％/25.71％)(P<0.05)；添加的血清是否进行灭活对牛孤雌胚胎体外发育的影响不大，未灭活组的囊胚率和孵出囊胚率(40.23％/57.14％)略优于灭活组(38.95％/51.35％)。在黄牛卵母细胞孤雌激活后的第3d添加血清可得到较高的囊胚率和孵出囊胚率(46.55％/53.70％)，而以孤雌激活后的第3d添加10％FBS囊胚发育率最高(45.97％)：综合卵裂率和囊胚发育率，对4种培养液比较后认为黄牛孤雌胚胎的体外培养液应首选SOFaa。 3.孤雌胚胎体外培养时有颗粒细胞单层组的卵裂率、囊胚率和孵出囊胚率(85.10％/41.81％/52.70％)较对照组(66.13％/7.32％/0％)均差异显著(P<0.05)；壁颗粒细胞和丘颗粒细胞单层均能较好地支持黄牛孤雌胚胎的体外发育，其卵裂率、囊胚率和孵出囊胚率分别为86.11％/83.72％、40.32％/41.67％、52.0％/53.33％，无显著差异(P>0.05)；来自黄牛、猪和小鼠的颗粒细胞单层在支持黄牛孤雌胚胎体外发育方面无种属特异性，其卵裂率、囊胚率和孵出囊胚率分别为83.42％/85.16％/82.58％、42.17％/41.67％/39.45％、 54.29％/52.73％/48.84％，3组之间无显著差异(P>0.05)；将培养2d和4d后的颗粒细胞单层分别用于胚胎的体外共培养，其卵裂率和囊胚发育率与对照组相比差异不显著(P>0.05)，但4d组与对照组之间差异显著(P<0.05)，3组在孵出囊胚率方面均无显著差异(P>0.05)；就囊胚发育率而言，共培养的第3/6d两次更换单层与共培养的第4d更换单层和始终不更换单层的对照组相比无显著差异(P>0.05)，但第4d更换单层与对照组相比差异显著(P<0.05)，3组在孵出囊胚率方面差异不显著(P>0.05)。 4.将卵母细胞在体外成熟培养17～19h、19～21h和21～23h后分别进行去核并构建核移植胚胎，3组的卵裂率和囊胚率无显著差异(P>0.05)，17～19h组和19～21h组的去核率高于21～23h组且差异显著(P<0.05)，而19～21h组的囊胚发育率优于其它两组；卵母细胞体外成熟培养19～21h后去核并构建核移植胚胎，经体外培养1～3h、3～5h和5～7h后再进行激活，结果表明核移植胚胎在体外培养3～5h进行化学激活可以得到较高的卵裂率(75.0％)和囊胚发育率(11.46％)。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

文献综述第一章哺乳动物卵母细胞体外成熟和早期胚胎体外培养的研究进展

1.1哺乳动物卵母细胞体外成熟的研究进展

1.1.1卵泡卵母细胞的获得

1.1.2卵母细胞成熟的机理

1.1.3卵母细胞成熟的标志

1.1.4卵母细胞成熟的判断

1.1.5卵母细胞体外成熟的影响因素

1.1.6存在的问题和展望

1.2哺乳动物早期胚胎体外培养的研究进展

1.2.1研究概况

1.2.2早期胚胎的发育阻滞

1.2.3胚胎体外培养方法

1.2.4影响早期胚胎体外发育的因素

1.2.5存在的问题与展望

文献综述第二章哺乳动物体细胞核移植研究进展

2.1哺乳动物细胞核移植研究概况

2.1.1胚胎细胞核移植

2.1.2同种体细胞核移植

2.2核移植的基本程序

2.2.1供体细胞的选择

2.2.2受体细胞的选择和去核

2.2.3供体细胞与受体细胞重组

2.2.4重组胚的激活

2.2.5重组胚的体外培养

2.3哺乳动物核移植相关机理的研究

2.3.1供体核与受体胞质的相互作用

2.3.2供体核的重编程

2.4影响核移植效率的因素

2.4.1细胞周期同步化对核移植胚的影响

2.4.2卵母细胞成熟质量对核移植胚的影响

2.4.3供体细胞对核移植胚的影响

2.4.4去核操作对核移植胚的影响

2.4.5融合—激活方案对核移植胚的影响

2.5体细胞核移植存在的问题

2.5.1总效率低，成本高

2.5.2流产率高，产仔率低

2.5.3动物出生体重过大，死亡率高

实验研究第三章黄牛卵母细胞的体外成熟培养

3.1材料

3.1.1牛卵巢的采集

3.1.2主要试剂

3.1.3主要仪器

3.2方法

3.2.1牛卵丘-卵母细胞复合体的回收

3.2.2卵母细胞的体外成熟培养

3.2.3成熟卵母细胞孤雌激活和孤雌胚的体外培养

3.2.4试验设计

3.2.5数据分析

3.3结果

3.3.1不同浓度HMG对牛卵母细胞体外成熟的影响

3.3.2 ITS对牛卵母细胞体外成熟的影响

3.3.3卵巢保存温度对牛卵母细胞体外成熟的影响

3.3.4卵巢保存时间对牛卵母细胞体外成熟的影响

3.3.5卵巢所处性周期阶段对牛卵母细胞体外成熟的影响

3.4讨论

3.4.1不同浓度HMG对牛卵母细胞体外成熟的影响

3.4.2 ITS对牛卵母细胞体外成熟的影响

3.4.3卵巢保存温度对牛卵母细胞体外成熟的影响

3.4.4卵巢保存时间对牛卵母细胞体外成熟的影响

3.4.5卵巢所处性周期阶段对牛卵母细胞体外成熟的影响

3.5小结

实验研究第四章黄牛孤雌胚胎体外培养体系的优化

4.1材料

4.1.1牛卵巢的采集

4.1.2主要试剂

4.1.3主要仪器

4.2方法

4.2.1卵丘卵母细胞复合体(COCs)的获得与体外成熟培养

4.2.2成熟卵母细胞的孤雌激活和孤雌胚的体外培养

4.2.3试验设计

4.2.4数据处理

4.3结果

4.3.1不同微滴体积对黄牛孤雌胚体外发育的影响

4.3.2不同换液体积对黄牛孤雌胚体外发育的影响

4.3.3血清灭活对黄牛孤雌胚体外发育的影响

4.3.4不同添加血清时间对黄牛孤雌胚体外发育的影响

4.3.5不同添加血清浓度对黄牛孤雌胚体外发育的影响

4.3.6不同培养体系对黄牛孤雌胚体外发育的影响

4.4讨论

4.4.1不同微滴体积对黄牛孤雌胚体外发育的影响

4.4.2不同换液体积对黄牛孤雌胚体外发育的影响

4.4.3血清灭活对黄牛孤雌胚体外发育的影响

4.4.4血清添加时间和添加浓度对黄牛孤雌胚体外发育的影响

4.4.5不同培养体系对黄牛孤雌胚体外发育的影响

4.5 小结

实验研究第五章颗粒细胞单层对黄牛孤雌胚体外发育的影响

5.1材料

5.1.1牛卵巢的采集

5.1.2主要试剂

5.1.3主要仪器

5.2方法

5.2.1卵丘卵母细胞复合体(COCs)的获得与体外成熟培养

5.2.2颗粒细胞单层的制备

5.2.3成熟卵母细胞的孤雌激活和孤雌胚的体外培养

5.2.4试验设计

5.2.5数据处理

5.3结果

5.3.1有无颗粒细胞单层对黄牛孤雌胚胎体外发育的影响

5.3.2不同类型的颗粒细胞单层对黄牛孤雌胚胎体外发育的影响

5.3.3不同种属的颗粒细胞单层对黄牛孤雌胚胎体外发育的影响

5.3.4颗粒细胞单层体外培养时间对黄牛孤雌胚胎体外发育的影响

5.3.5不同时间更换单层对黄牛孤雌胚胎体外发育的影响

5.4 讨论

5.4.1有无颗粒细胞单层对黄牛孤雌胚体外发育的影响

5.4.2不同类型颗粒细胞单层对黄牛孤雌胚体外发育的影响

5.4.3不同种属的颗粒细胞单层对黄牛孤雌胚胎体外发育的影响

5.4.4颗粒细胞单层体外培养时间对黄牛孤雌胚胎体外发育的影响

5.4.5不同时间更换单层对黄牛孤雌胚胎体外发育的影响

5.5 小结

实验研究第六章黄牛体细胞核移植胚的构建初探

6.1材料

6.1.1牛卵巢的采集

6.1.2主要试剂

6.1.3主要仪器

6.2方法

6.2.1卵丘卵母细胞复合体(COCs)的获得与体外成熟培养

6.2.2卵母细胞的去核

6.2.3供体细胞的准备

6.2.4核移植胚的构建

6.2.5核移植胚的激活

6.2.6核移植胚的体外培养

6.2.7试验设计

6.2.8数据处理

6.3结果

6.3.1不同成熟时间对核移植胚胎体外发育的影响

6.3.2不同核/质作用时间对核移植胚胎体外发育的影响

6.4 讨论

6.4.1不同体外成熟培养时间对核移植胚胎体外发育的影响

6.4.2不同核/质作用时间对核移植胚胎体外发育的影响

6.5 小结

全文结论

参考文献

附 录

致谢

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