不同培养体系对延边黄牛体细胞克隆胚胎体外发育的影响

摘要

延边黄牛以其独特的肉用品质，在国际市场享有很高的声誉，但是延边黄牛存在生长速度慢，产肉性能低，良种覆盖率低等缺点，主要原因是受技术的发展、体制和经费的制约，在改良和选育过程中科技贡献率低，成果转化慢，育种周期长。近年来，体细胞克隆技术得到迅速发展，用于育种改良时与传统方式相比，可使育种周期缩短几十年，如再配合过去的繁育技术体系，可使良种母牛的繁殖潜力大幅度提高，这对加快中国延边黄牛资源保护和开发进程，建设中国特色延边黄牛肉牛产业具有重大意义。 本研究以新鲜的颗粒细胞作为供核细胞，以延边黄牛M Ⅱ期去核的卵母细胞作为受体，点压法将供体颗粒细胞注入到卵母细胞卵黄周隙中，0.3M甘露醇融合液中施加20μs时长的一次电脉冲刺激使之融合，5μM的离子霉素预激活5min，然后移入2mM的6-DMAP中激活培养4h，按实验设计分组移入培养液中，定期更换培养液并观察胚胎发育情况，结果以卵裂率、4-6细胞发育率和8-16细胞发育率评价。结果如下： (1)使用CRlaa和TCM-199培养液培养时，4-6细胞发育率和8-16细胞发育率分别为63.6％、57.9％和27.1％、28.2％，显著高于mSOF培养液培养的43.2％和17.3％。 (2)在CRlaa培养液中添加1mM的GSH时，卵裂率、4-6细胞发育率和8-16细胞发育率分别为61.0％、66.0％和45.2％，要优于添加2mM和3mM组。 (3)72h之前不添加血清时4-6细胞发育率比对照组(CRlaa)高(69.8％vs 55.6％)，8-16细胞发育率却比对照组低(19.9％vs 31.0％)，差异均显著(P<0.05)；培养第五天添加葡萄糖时能显著提高胚胎8-16细胞发育率(40.5 vs 31.0％)。 (4)以CRlaa和TCM-199为基础液时，输卵管上皮细胞和颗粒细胞共培养在卵裂率、胚胎4-6细胞发育率和8-16细胞发育率方面都有显著提高(P<0.05)。使用SPSS14.0软件对结果进行方差分析并多重比较后，综合考虑实验结果和方便操作时间与过程，得出以下结论：含5％FBS的CRlaa和TCM-199培养液适用于延边黄牛体细胞克隆胚胎的体外培养。在含5％FBS的cRlaa培养液中添加1mM的GSH能显著提高延边黄牛体细胞克隆胚胎的体外发育效率。延边黄牛体细胞克隆胚胎体外发育前期血清的存在能限制其发育，发育后期添加能量物质葡萄糖可以提高其发育率。以CRlaa和TCM-199作为基础液时，输卵管上皮细胞和颗粒细胞共培养均能显著提高延边黄牛体细胞克隆胚胎发育率。

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论文说明：注释表

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第一章绪论

1.1延边黄牛种质资源简介

1.2哺乳动物体细胞克隆的研究进展

1.3哺乳动物体细胞克隆的应用价值与前景

1.4体外培养系统对家畜胚胎体外发育的影响

1.5胚胎体外培养的应用前景及存在的问题

1.6体细胞克隆胚胎体外培养体系的研究现状与应用前景

第二章材料与方法

2.1仪器与材料

2.2实验方法

2.3实验内容

2.4统计分析方法

第三章结果与分析

3.1不同培养液对延边黄牛体细胞克隆胚胎体外发育的影响

3.2 GSH对延边黄牛体细胞克隆胚胎体外发育的影响

3.3序贯式培养对延边黄牛体细胞克隆胚胎体外发育的影响

3.4共培养对延边黄牛体细胞克隆胚胎体外发育的影响(Ⅰ)

3.5共培养对延边黄牛体细胞克隆胚胎体外发育的影响(Ⅱ)

第四章讨论

4.1不同培养液对延边黄牛体细胞克隆胚胎体外发育的影响

4.2 GSH在延边黄牛体细胞克隆胚胎体外发育中的作用

4.3序贯式培养对延边黄牛体细胞克隆胚胎体外发育的影响

4.4共培养对延边黄牛体细胞克隆胚胎体外发育的影响

第五章结论

致谢

参考文献