禾谷镰刀菌激酶组代谢谱和腺苷酸环化相关蛋白FgCap1功能研究

摘要

由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）为主要病原所引起的小麦赤霉病是世界范围内小麦产区的主要病害之一。该病不但能造成小麦产量的巨大损失，还能在侵染致病过程中产生名为脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)危害人畜的健康。前面的研究中已经获得96个禾谷镰刀菌激酶基因缺失突变体，这些激酶中28个基因在酿酒酵母中无同源基因，其中12个没有观察到明显的表型变化。这些没有表型变化的基因推测可能在胞内代谢通路上发生变化从而引起菌体代谢物。代谢组学的中心目的就是在特定的环境条件下分析由基因调控所引起的生物系统中代谢产物的变化，因此代谢组学可以将基因型和表型同代谢物联系起来。在本研究中，我们通过气相色谱质谱联用(GC/MS)分析93个激酶缺失突变体中代谢谱变化。在基本培养基(MM)和完全培养基(CM)中培养15天的所有突变体，通过滤布过滤菌丝后液氮研磨。研磨后样品使用甲醇提取，代谢物通过氯甲酸甲酯(MCF)三甲基硅烷(TMS)和衍生化。与MM培养的菌丝相比，在CM中的菌丝产生更多的亚油酸、山梨醇和蔗糖，但是阿拉伯糖醇的产量降低。此外，MM培养基中无明显的代谢谱变化的突变体在CM中也表现出巨大的代谢变化，表明培养条件和基因调控共同影响代谢物种类和含量。禾谷镰刀菌中重要的三条MAPK通路在植物侵染和其他很多生物过程中扮演着重要的作用。FgHog1通路突变体在两种培养基中相对于野生型PH-1都显示出阿拉伯糖醇和山梨醇显著降低并聚类在一起。FgMgv1通路缺失突变体在MM中和FgGpmk1通路缺失突变体聚类在一起。有趣的是，在CM中FgMgv1通路缺失突变体和其他11个基因缺失突变体相对于野生型表现出极其明显的阿拉伯糖醇的升高和松二糖降低并聚类在一起。后续研究发现该通路缺失突变体影响了甘油脂类代谢、戊糖和葡萄糖醛酸酯转变和半乳糖代谢。OPLS-DA分析发现有性生殖与野生型PH-1无明显差异的突变体和不产生子囊壳的突变体之间有着明显的区分，表明这两个组别的突变体间有着相对明显的代谢谱差异，进一步鉴定出14个VIP值大于1的代谢产物对这两组差异贡献最大。对12个无明显表型的基因突变体分析发现三个在代谢谱上有明显的变化，此三个突变体主要影响碳代谢过程。准确定义这三个基因在代谢中的功能需要更多的数据支持。
　　单端孢霉烯毒素合成基因(TRI)的表达以及DON的产生受到环腺苷酸单磷酸-蛋白激酶A(cAMP-PKA)通路和两个通路特异转录因子（TRI6和TRI10）的调控。有趣的是，TRI6基因缺失突变体中cAMP通路多个组分表达下降，包括在禾谷镰刀菌中还未报道的腺苷酸结合蛋白基因FgCAP1。在本研究中，我们证明了FgCap1与腺苷酸环化酶(Fac1)互作，在缺失FgCAP1的时候细胞内cAMP和PKA活性显著下降。Fgcap1缺失突变体在营养生长、产孢和致病力方面有着明显的下降。同时突变体在DON产量和TRI基因的表达上也显著下降，这一表型可以通过加入外源cAMP得到恢复，这也表明FgCap1是依靠PKA调控DON合成。野生型在DON产毒诱导条件下cAMP和FgCAP1的表达升高但是在tri6突变体中则不然。此外，在FgCAP1的启动子区域含有一个可能的TRI6结合位点，该位点对于DON合成有着重要的作用，但是这一位点对于菌丝生长、产孢和致病没有影响。此外，FgCap1表现出和肌动蛋白的定位相似位于菌丝生长顶端。磷酸化蛋白组分析鉴定出FgCap1的磷酸化位点S353。FgCAP1的S353点突变获得的突变体S353A在营养生长、产孢和DON产生方面都没有影响。但是，FgCAP1S353A等位基因的表达不能够互补Fgcap1突变体在植物侵染中的作用，显示出S353位点在致病力方面的重要作用。总体而言，我们的结果表明FgCAP1通过cAMP信号通路调节DON产生同时受到TRI6的反馈调节。但是FgCap1的磷酸化位点S353可能与cAMP-PKA通路无关只影响对植物的侵染。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 代谢组学定义

1．2 代谢组学研究的一般流程

1．2．1 样品准备

1．2．2 数据获得

1．2．3 数据分析

1．3 代谢组学应用

1．3．1 代谢组学在微生物领域的应用

1．3．2 代谢组学在禾谷镰刀菌中的应用

1．4 FgCAP1研究进展

1．5 本研究的目的意义

2．1 材料与方法

2．1．1 实验菌株

2．1．2 主要培养基

2．1．3 主要试剂

2．1．4 代谢样品准备

2．1．5 样品衍生化

2．1．6 仪器参数

2．1．7 数据处理

2．1．8 数据标准化

2．1．9 代谢物检索

2．2 结果

2．2．1 培养时间对代谢状态的影响

2．2．2 MM和CM培养基中的激酶组代谢数据标准化和有效性验证

2．2．3 MM和CM中代谢物鉴定和差异

2．2．4 MM和CM中激酶组代谢谱层次聚类分析

2．2．5 MAPK通路缺失突变体对代谢通路影响

2．2．6 缺失突变体表型和代谢物之间的联系

2．2．7 未知功能激酶代谢变化

2．3 讨论

第三章 禾谷镰刀菌腺苷酸环化相关蛋白FgCap1功能研究

3．1 材料方法

3．1．1 本实验所用到得引物

3．1．2 本实验所有用的所有菌株

3．1．3 主要培养基

3．1．3 构建Fgcap1缺失突变体

3．1．6 植物侵染和DON检测

3．1．7 FgCap1和Fac1互作的免疫共沉淀验证

3．2 结果

3．2．1 FgcAp1影响营养生长和孢子形态

3．2．2 FgCAP1在植物侵染方面存在缺陷

3．2．3 FgCAP1在调节DON合成中起到重要作用

3．2．4 FgCap1调节DON产生与cAMP信号通路有关

3．2．5 FgCap1和Fac1在免疫共沉淀实验中互作

3．2．6 FgCAP1和TRI6在DON产生阶段控制cAMP信号通路反馈调节

3．2．7 FgCap1定位于菌丝生长顶端

3．2．8 FgCap1的磷酸化位点S353在菌丝生长和致病方面有着重要作用

3．2．9 S353磷酸化位点不影响cAMP信号通路但对侵染扩展很重要

3．3 讨论

4．1 代谢谱部分

4．2 腺苷酸环化相关蛋白基因部分

参考文献

致谢

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