球孢白僵菌热激蛋白家族、Ca2+ATP激酶Pmr1、磷酸化酶Cdc14及腺苷酸环化酶的功能解析

摘要

球孢白僵菌是广泛用于农林害虫生物防治的丝状昆虫病原真菌(filamentousentomopathogen)，其田间应用往往受到各种环境因素的制约。探索生防真菌的抗逆生物学机制，并用于菌种遗传性状的维护和改良，是利用真菌开展害虫生物防治的理论和技术基础。
　　本论文主要研究了球孢白僵菌热激蛋白家族、钙离子ATP激酶家族、磷酸化酶Cdc14以及腺苷酸环化酶的抗逆生物学功能及其对毒力贡献，并尝试解析可能的分子调控机制。主要研究内容和成果概述如下:
　　球孢白僵菌热激蛋白家族的功能解析热激蛋白HSP(heat shock proteins)是生物体在胁迫条件下大量合成的一类蛋白，家族成员众多，根据分子量大小分为sHsp（小热激蛋白）、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp90及Hsp100六个亚家族。与酵母HSP及其热激转录因子的蛋白序列比对，球孢白僵菌基因组编码的HSP蛋白多达30个，包括3个sHsp，6个Hsp40，2个Hsp60，15个Hsp70，1个Hsp82，1个Hsp90，2个Hsp100及3个类似热激转录因子的蛋白Hsf1～3。通过构建和分析各Hsp和Hsf的单基因敲除菌株和回补菌株并与野生型进行比较，发现它们对宿主菌的生长、产孢、营养利用、多胁迫反应、细胞结构、侵染力及胞内物质代谢等诸方面扮演着或举足轻重或影响显著的角色。其中，sHsp基因的缺失导致菌落生长受到抑制和对氧化、胞壁干扰、多菌灵、高温及UV-B紫外辐射的敏感性升高，并伴随毒力的小幅下降。Hsp40基因的敲除导致生长缓慢(△hsp40a及△hsp40c的生长被抑制40％以上)，产孢量下降（以△hsp40c为最），抗氧化、高渗、胞壁干扰、多菌灵、高温及UV-B辐射胁迫的能力及侵染力显著降低，其中△40a的高渗敏感性升高70％，完全丧失经体壁侵染大蜡螟幼虫的能力。Hsp60基因参与正向调控产孢、多胁迫应答反应及侵染力，其中△hsp60a的孢子梗分化受阻且数目稀少，使分生孢子产量大幅下降。Hsp70亚家族有9个基因是敲除致死的，6个基因的缺失导致生长、产孢、多胁迫应答及生防潜能指标小幅下降。Hsp90基因也是敲除致死的，而Hsp82基因的缺失导致产孢量、多胁迫应答和生防潜能指标的下降。Hsp100基因的敲除对生长、产孢、多胁迫应答及生防潜能指标具有重要影响，敲除株表现产孢、耐高温能力及侵染力的严重缺陷。3个Hsf基因的敲除导致不同的表现变化。△Hsf1的产孢量显著下降，抗氧化、抗胞壁干扰、耐高温、抗多菌的能力下降25～78％;△Hsf2表现严重的生长、产孢和侵染力缺陷，对氧化、高渗及胞壁胁迫的敏感性升高，但对多菌灵的抗性增强43％。△Hsf3仅表现轻微的生长缺陷，但产孢量和抗胞壁胁迫的能力大幅下降，对氧化及多菌灵的敏感性和抗高渗能力小幅上升，而抗紫外辐射能力和侵染力明显下降。各热激蛋白和转录因子还对细胞内甘油、海藻糖及甘露醇的含量以及酸碱度平衡也具有重要影响，且彼此之间存在冗余、互补及调控的关系。综合看，Hsf1、Hsp78和Hsp104是重要的热敏因子，Hsf1也是重要的孢壁完整性维持因子，Hsp40a是重要的渗透压敏感因子和毒力因子，Hsf2、Hsf3、Hsp78、Hsp60a及Hsp40c是重要的产孢调控因子。
　　球孢白僵菌P型钙离子ATP激酶Bbpmr1的功能分析真核生物P型钙离子ATP激酶Pmr1是钙离子—钙调蛋白信号通路中的重要元件，但其通过与其它信号通路的相互作用而控制细胞的生理过程罕见研究报道。通过分析位于球孢白僵菌高尔基体中Pmr1(Bbpmr1)的结构特征并对其缺失菌株进行正常和胁迫条件下的多表型及转录分析，发现Bbpmr1基因的缺失导致营养利用、生长、产孢及萌发等诸多严重缺陷。缺失株对氧化、高渗、胞壁干扰、杀菌剂及金属离子等胁迫的敏感性显著升高，其分子孢子耐高温能力、抗UV-B紫外辐射的能力及毒力均损失一半左右。伴随多表型的变化，敲除菌株中无性发育相关4个基因的转录水平较对照菌株下调75％以上，而且多个信号通路相关基因（各MAPK通路中的级联基因、Ras、Ssk1、TOR信号通路）及下游效应基因在不同类型化学胁迫下的转录水平都大幅下调。结果表明，Bbpmr1通过多条信号通路的功能对话正向调控球孢白僵菌的生长、产孢、多胁迫耐受力及侵染力。
　　球孢白僵菌磷酸化酶Cdc14的功能及其细胞信号网络枢纽作用球孢白僵菌Cdc14磷酸化酶被证明定位于细胞核内。Cdc14的失活导致13％的细胞形成三个或三个以上的细胞核且芽生孢子产量下降89％，表明胞质分裂严重受损。因此，△cdc14表现营养利用和菌落生长的严重缺陷，分生孢子产量大幅下降。这些表型与若干细胞分裂和产孢相关基因的转录表达受抑制是一致的。而且，△cdc14在菌落生长期间对氧化、渗透压、胞壁干扰及杀菌剂胁迫都更加敏感，其分生孢子的耐高温能力、抗UV-B紫外辐射的能力及侵染力下降41～70％。这些抗逆表型的变化与61个细胞信号传导(MAPK级联基因、Ras1/Ras2、PKA/PKC及Snf1)、抗氧化、耐高渗和胞壁完整性相关的效应基因的转录水平变化基本一致。有趣的是，ELISA实验结果显示，敲除菌株中Hog1及Slt2的磷酸化水平在不同化学胁迫条件下都大幅下调。由此说明，Cdc14作为信号网络的枢纽而调控球孢白僵菌的胞质分裂、生长发育、多胁迫应答反应及毒力。
　　腺苷酸环化酶在球孢白僵菌及罗伯茨绿僵菌中的功能比较腺苷酸环化酶(AC)是真菌cAMP信号通路中的一个关键元件。球孢白僵菌及罗伯茨绿僵菌(Metarhiziumrobertsii)各有一个结构相似但功能分化的AC，分别为BbAC和MrAC。两个AC蛋白的失活都导致在富营养和贫瘠营养基质上的菌落生长放慢，但在富营养平板上的产孢量变化趋势相反，即培养期间△BbAC的分生孢子产量提高48％～1.1倍，而△MrAC的产孢量却下降52～68％。两个敲除菌株的生长缺陷可通过在培养基中添加cAMP而部分缓解。△BbAC对氧化、高渗、胞壁干扰、多菌灵及几种金属离子（Cu2+除外）胁迫都更敏感，而△MrAC更抗高渗胁迫，且对刚果红和多菌灵胁迫无明显应答反应。在对敏感寄主的标准化侵染处理中，△BbAC的半致死时间比对照菌株延长10.9 d，而△MrAC只延长1.4 d。这些结果证明，BbAC和MrAC分别对球孢白僵菌和罗伯茨绿僵菌的产孢、侵染力及多胁迫应答的影响是不同的，因而对宿主菌生防潜能的贡献大小及方式也大相径庭。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

1 真菌热激蛋白家族、钙离子ATP激酶家族、磷酸化酶Cdc14及腺苷酸环化酶的研究现状

1．1 生防真菌的胁迫应答机制

1．1．1 抗氧化

1．1．2 耐紫外辐射

1．1．3 耐高温胁迫

1．1．4 耐化学农药

1．1．5 其它抗逆机制

1．2 热激蛋白概述及其对生防真菌的意义

1．2．1 HSP主要特征

1．2．2 HSP家族成员的结构与分类

1．2．3 HSP家族成员的生物学功能

1．2．4 HSP家族的基因表达及调控

1．2．5 HSP家族蛋白对害虫生防真菌的意义

1．3 钙离子ATP激酶概述及其抗逆生物学功能

1．3．1 P型钙离子ATP激酶的定位与分类

1．3．2 P型钙离子ATP激酶的生物学功能

1．4 磷酸化酶Cdc14及腺苷酸环化酶的概述

1．5 展望

2 球孢白僵菌热激蛋白家族的功能解析及表达调控

2．1 材料

2．1．1 菌株及培养条件

2．1．2 试剂及试剂盒

2．2 方法

2．2．1 真菌核酸提取

2．2．2 球孢白僵菌Hsp和Hsf家族的基因克隆与分析

2．2．3 Hsp和Hsf家族单基因敲除／回补菌株的构建

2．2．4 表型分析

2．2．5 细胞外pH值测定

2．2．6 细胞壁损害程度的观察与测定

2．2．7 细胞内海藻糖、甘露醇及甘油含量的测定

2．2．8 表型相关基因转录水平的测定

2．2．9 数据统计与分析

2．3 结果与分析

2．3．1 球孢白僵菌Hsp和Hsf家族的构成及基本特征

2．3．2 Hsp和Hsf单基因缺失影响生长、产孢及孢子萌发

2．3．3 Hsp和Hsf单基因缺失影响对不同碳氮源的利用率

2．3．4 Hsp和Hsf单基因缺失影响菌落生长对化学胁迫剂的敏感性

2．3．5 Hsp和Hsf单基因缺失影响分生孢子对化学胁迫剂的敏感性

2．3．6 Hsp和Hsf单基因缺失影响生防潜能

2．3．7 Hsp和Hsf单基因缺失影响细胞壁完整性

2．3．8 Hsp和Hsf单基因缺失影响细胞内海藻糖、甘露醇及甘油积累水平

2．3．9 Hsp和Hsf单基因缺失影响pH适应性和pH平衡

2．3．10 Hsp和Hsf单基因缺失影响同一家族其它成员的转录表达

2．4 讨论

2．4．1 球孢白僵菌Hsp和Hsf家族成员对生长的影响

2．4．2 球孢白僵菌Hsp和Hsf家族成员对产孢的影响

2．4．3 球孢白僵菌Hsp和Hsf家族成员对细胞多胁迫应答的影响

2．4．4 球孢白僵菌Hsp和Hsf家族成员与细胞内胁迫保护因子积累的相互关系

2．4．5 球孢白僵菌 Hsp和Hsf家族成员之间的相互关系

3 球孢白僵菌P型钙离子ATP激酶Pmr1的功能解析

3．1 材料与方法

3．1．1 菌株及生长条件

3．1．2 Bbpmr1的基因克隆及序列分析

3．1．3 Bbpmr1基因的敲除／回补株构建与鉴定

3．1．4 正常培养条件下的生长速率和产孢量测定

3．1．5 不同营养条件下的菌落生长速率测定

3．1．6 不同化学胁迫下菌落生长速率测定

3．1．7 分生孢子对不同化学和环境胁迫的耐受力测定

3．1．8 毒力测定

3．1．9 表型相关基因的转录表达分析

3．1．10 数据分析

3．2 结果与分析

3．2．1 Bbpmr1的基本特征

3．2．2 Bbpmr1失活影响菌落生长、产孢及孢子活力

3．2．3 Bbpmr1失活降低不同碳氮源营养的利用效率及耐饥饿能力

3．2．4 Bbpmr1失活改变对不同金属离子的敏感性

3．2．5 Bbpmr1失活升高对不同类型化学胁迫的敏感性

3．2．6 Bbpmr1失活削弱生防潜能

3．2．7 Bbpmr1失活改变若干效应基因和信号基因的转录表达

3．3 讨论

4 球孢白僵菌磷酸化酶Cdc14的功能及其信号枢纽作用

4．1 材料与方法

4．1．1 菌株及培养条件

4．1．2 球孢白僵菌Cdc14基因的克隆及分析

4．1．3 Cdc14的细胞定位

4．1．4 Cdc14基因的敲除／回补菌株的构建与鉴定

4．1．5 细胞分裂的观察

4．1．6 菌落生长速率与分生孢子产量测定

4．1．7 细胞对不同类型胁迫应答反应的测定

4．1．8 毒力测定

4．1．9 表型相关基因转录水平测定

4．1．10 Hog1和Slt2的磷酸化水平测定

4．1．11 数据分析

4．2 结果与分析

4．2．1 球孢白僵菌Cdc14的基本特征

4．2．2 Cdc14失活导致胞质分裂失常和严重产孢缺陷

4．2．3 Cdc14失活降低多胁迫耐受力和生防潜能

4．2．4 Cdc14失活改变若干胁迫响应基因的转录表达

4．2．5 Cdc14失活改变CWI和HOG信号通路的磷酸化信号

4．3 讨论

5 两种昆虫病原真菌中同源腺苷酸环化酶的功能比较

5．1 材料与方法

5．1．1 菌株与培养条件

5．1．2 BbAC及MrAC的克隆和分析

5．1．3 BbAC及MrAC的敲除／回补菌株构建与鉴定

5．1．4 生长速率及分生孢子产量测定

5．1．5 对化学／环境胁迫应答反应的测定

5．1．6 毒力测定

5．1．7 数据分析

5．2 结果与分析

5．2．1 BbAC及MrAC的特征及其单基因敲除与回补

5．2．2 BbAC和MrAC失活对生长、产孢及孢子萌发的影响

5．2．3 BbAC与MrAC失活对细胞胁迫应答的影响

5．2．4 BbAC和MrAC失活对两种真菌生防潜能的影响

5．3 讨论

6 结语

参考文献

攻读学位期间的主要成果