大白菜pol CMS恢复基因BrRfp1的图位克隆和不同恢复基因位点恢复机理的研究

摘要

波里马细胞质雄性不育(pol CMS)是在甘蓝型油菜中发现的第一个有实用价值的胞质雄性不育类型，后被转育大白菜等十字花科作物中，在十字花科作物的杂交育种中有重要的应用价值。Pol胞质被转育到大白菜后，在大白菜中有天然的恢复系，成为大白菜杂交育种应用最广泛的不育源之一。大白菜pol CMS恢复基因的图位克隆和恢复机理的研究，对于pol CMS在大白菜杂交育种中的应用，加快育种进程有重要意义，另外对细胞质遗传和核质互作研究也有重要价值。本研究以大白菜pol CMS不育系94C9和4个恢复系92S105、01S325、00S109和88S148为材料，对4个恢复系的恢复基因进行了等位性分析，并图位克隆了恢复基因BrRfp1，找出了非恢复等位基因的关键突变位点，还研究了2个恢复基因的恢复机理。这些研究为深入理解pol CMS/Rf系统的分子机理奠定基础。本研究主要取得了如下结果:
　　1.在4个大白菜pol CMS的恢复系中鉴定出2个BrRfp位点。恢复系92S105、01S325、00S109的恢复基因位于同一基因位点，恢复系88S148的恢复基因位于另外的基因位点，将这两个恢复基因位点命名为BrRfp1和BrRfp2。
　　2.利用恢复系92S105和不育系94C9构建的BC1F1和BC1F2定位群体，图位克隆了BrRfp1基因。BrRfp1基因是位于大白菜A09染色体上的一个编码PPR蛋白的基因。
　　3.通过比较4个Br Rfp1基因和6个非恢复等位基因的推导氨基酸序列，发现BrRfp1基因第11个PPR基序中的3个氨基酸突变在非恢复等位基因的推导氨基酸序列中都存在，可能是导致这些基因丧失恢复功能的关键突变。
　　4.根据BrRfp1基因和非恢复等位基因的核苷酸序列多态性，开发了与BrRfp1基因共分离的显性标记SC718，该标记在不同群体中均可检测出BrRfp1基因是否存在，可用于分子标记辅助育种和大白菜种质资源中新恢复系的筛选。
　　5.全不育、半恢复和全恢复花蕾的花药在组织形态学上有明显的差异。全不育花蕾在1 mm时花药已经停止发育，半恢复花蕾的花药只能发育出2-3个药室，全恢复花蕾的花药则发育出完整的4个药室。
　　6.采用环化RT-PCR的方法，研究了orf224-atp6转录本在全不育、半恢复和全恢复花蕾中的差异。结果表明，全不育和半恢复花蕾中的表达相同，都能检测出2个orf224-atp6转录本，但在全恢复的花蕾中能检测出3个orf224-atp6转录本。
　　7.采用RT-qPCR的方法，对orf224和atp6基因在全不育、半恢复和全恢复花蕾中的表达进行了定量。结果发现，与全不育花蕾相比，半恢复和全恢复花蕾中orf224基因mRNA的量都显著降低，且二者之间差异不显著。半恢复和全恢复花蕾中atp6基因mRNA的量也比不育花蕾显著降低，但在花蕾小于4mm时，半恢复花蕾中atp6基因mRNA的量比全恢复花蕾中明显减少，因此推测BrRfp2基因引起育性半恢复的原因可能与atp6基因mRNA的量显著减少有关。
　　8.采用western杂交的方法，研究了ORF224蛋白在不育、半恢复和全恢复花蕾中积累量的差异。结果表明，与不育花蕾相比，半恢复和全恢复花蕾中ORF224蛋白的积累量都显著降低，几乎检测不到。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 植物CMS基因和恢复基因的研究进展

1．2．1 植物CMS基因的鉴定和序列特征

1．2．2 恢复基因的鉴定和序列特征

1．3 植物CMS基因引起雄性不育的分子机理

1．3．1 毒蛋白模型

1．3．2 能量供应不足模型

1．3．3 异常程序性死亡模型

1．3．4 线粒体逆向信号调节模型

1．4 植物CMS的育性恢复机理

1．4．1 基因组水平

1．4．2 转录后水平

1．4．3 翻译或翻译后水平

1．4．4 代谢水平

1．6．1 Pol CMS的不育基因和不育机理

1．6．2 Pol CMS的恢复基因和恢复机理

1．7 本课题组对大白菜pol CMS／Rf系统的研究进展

1．8 本研究的目的和意义

1．9 本研究的技术路线

第二章 大白菜pol CMS不同恢复系恢复基因的等位性分析

2．1．1 植物材料

2．1．2 方法

2．2 结果分析

2．3 讨论

第三章 大白菜pol CMS的育性恢复基因BrRfp1的图位克隆

3．1．1 植物材料

3．1．2 亲本基因组重测序

3．1．3 SSR标记和InDel标记的开发

3．1．4 基因组DNA的提取、PCR和电泳分析

3．1．5 遗传图谱、物理图谱的构建和候选基因的确定

3．1．6 候选基因的克隆和序列分析

3．2 结果分析

3．2．1 恢复基因遗传规律的分析和初步定位

3．2．2 全基因组重测序

3．2．3 基于基因组重测序的精细定位

3．2．4 大白菜BrRfp1候选基因的克隆和序列分析

3．2．5 大白菜恢复基因共分离分子标记的开发和验证

3．3 讨论

第四章 大白菜pol CMS不同恢复基因位点恢复机理研究

4．1．1 植物材料

4．1．2 石蜡切片的制作和观察

4．1．3 总RNA的提取

4．1．4 环化RT-PCR

4．1．5 RT-qPCR

4．1．6 线粒体的纯化和线粒体蛋白的提取

4．1．7 线粒体蛋白定量

4．1．8 抗体制备

4．1．9 Western杂交

4．2 结果与分析

4．2．1 不同大小全不育、半恢复和全恢复花蕾的石蜡切片观察

4．2．2 全不育、半恢复和全恢复花蕾中orf224-atp6转录本的差异

4．2．3 orf224和atp6基因在不同大小的不育、半恢复和全恢复花蕾中的定量分析

4．2．4 ORF224蛋白在全不育、半恢复和全恢复花蕾中的Western blot检测

4．3 讨论

第五章 结论、创新点和展望

5．1 结论

5．2 创新点

5．3 展望

参考文献

附录

缩略词

致谢

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