公开/公告号CN1954070A
专利类型发明专利
公开/公告日2007-04-25
原文格式PDF
申请/专利权人 日本烟草产业株式会社;欣根塔有限公司;
申请/专利号CN200480023799.0
发明设计人 小林俊之;
申请日2004-06-09
分类号C12N15/29(20060101);A01H5/00(20060101);
代理机构11105 北京市柳沈律师事务所;
代理人张平元;赵仁临
地址 日本东京都
入库时间 2023-12-17 18:37:50
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-08-06
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N15/29 授权公告日:20091021 终止日期:20130609 申请日:20040609
专利权的终止
2009-10-21
授权
授权
2008-01-23
专利申请权、专利权的转移(专利申请权的转移) 变更前: 变更后: 变更前:
专利申请权、专利权的转移(专利申请权的转移)
2007-06-13
实质审查的生效
实质审查的生效
2007-04-25
公开
公开
技术领域
本发明要求平成15年6月18日提出的特愿2003-173927的优先权。
本发明所属的技术领域
本发明涉及将育性恢复基因导入到多个基因位点的杂交植物及其应用。
背景技术
现有技术
在水稻等自交植物中进行品种间杂交时，首先，为了避免自花授粉，有必要在颖花开花前完全去除颖花内的雄蕊，然后使用进行杂交的来自花粉亲本品种的花粉进行受精。可是，通过这样的人工操作的杂交方法很难适合于进行商业规模的大量的杂种种子生产。
因此，杂交品种的生产使用了利用细胞质雄性不育的三系法。所谓三系法，是指使用含有雄性不育细胞质的不育系、具有配子体育性恢复基因系的恢复系、以及核基因与不育系相同但不具有不育细胞质的保持系的方法。使用这3种系，(i)可以通过将恢复系的花粉授粉于不育系来获得杂交种子、(ii)另一方面，可以通过使保持系的花粉授粉于不育系来维持不育系。
为了商业性地生产杂交种子，利用了在雄性不育细胞质以及核中编码的育性恢复基因。育性恢复基因按照其作用机理可以分类为配子体型和孢子体型。配子体型是由花粉的基因类型决定是否恢复花粉育性，已知有对于水稻的BT型雄性不育细胞质的育性恢复基因Rf-1或对于玉米的S型雄性不育细胞质的恢复基因。另一方面，孢子体型是由产生花粉的植物体的基因类型决定是否恢复花粉育性，已知有对于水稻的WA型雄性不育细胞质的育性恢复基因Rf-1或对于玉米的T型雄性不育细胞质的育性恢复基因等。
如果利用配子体型育性恢复基因培育杂交品种，由于在杂交品种的花药中，具有育性恢复基因的花粉和不具有的花粉分离成1∶1，因此，理论的花粉育性为50％。为一般品种的理论的花粉育性100％的一半，作为使杂交品种的种子生产的稳定性降低的主要原因，是令人畏惧的。实际上，利用了水稻的BT型雄性不育细胞质及其育性恢复基因Rf-1的杂交品种，通常已知其耐冷性弱，其原因可以认为是由于理论花粉育性低(50％)。
另一方面，在孢子体型中也存在如下的问题。虽然可以认为对于水稻的WA细胞质的育性恢复是通过多个育性恢复基因赋予的，但其数量和在染色体上的位置没有详细地鉴定。因此，作为对WA细胞质的恢复系，为了在杂交育种中使用，除了产量和植物型等特性优异以外，有必要通过对与不育系的杂交F1代的种子育性研究来显示出对WA细胞质具有完全恢复能力。无论育性恢复能力以外的特性多么优异，只要与WA细胞质雄性不育系的杂交下一代的种子育性不完全，就不能作为恢复系来利用。另外，如上所述，由于没有精确地鉴定恢复系中育性恢复基因的数量和位点，只改良育性恢复能力同时又维持其它的特性是困难的。
因此，希望得到用于制造具有高育性的杂交品种的方法。
专利文献1：特开2002-345485号公报
专利文献2：国际公开第02/014506 A1号小册子
专利文献3：国际公开第03/027290 A1号小册子
专利文献4：国际公开第02/019803 A1号小册子
非专利文献1：Ahmed，M.I.，and Siddiq，E.A.(1998).Rice.In Hybridcultivar development，S.S.Banga and S.K.Banga，eds(Berlin：Springer Verlag)，pp.221-256.
非专利文献2：Dhillon，B.S.(1998).Maize.In Hybrid Cultivardevelopment，S.S.Banga and S.K.Banga，eds(Berlin：Springer Verlag)，pp.282-315.
非专利文献3：Wen，L.&Chase、C.D.(1999).Curr.Genet.35，p.521-526.
非专利文献4：Fukuta et al.1992，Jpn J.Breed.42(supl.1)p.164-165.
非专利文献5：Hiei et al.，Plant Journal(1994)，6(2)，p.272-282.
非专利文献6：Komari et al.，Plant Journal(1996)10，p.165-174.
非专利文献7：Ditta et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)，77：p.7347-7351.
非专利文献8：Lemas et al.，Plasmid 1992，27，p.161-163.
非专利文献9：Cui，X.，Wise，R.P. and Schanble，P.S.(1996) The rf2nuclear restorer gene of male-sterile T-cytoplasm maize.Science，272，1334-1336.
非专利文献10：Liu，F.，Cui，X.，Horner，H.T.，Weiner，H.and Schnable，P.S.(2001)Mitochondrial aldehyde dehydrogenase activity is required for malefertility in maize.The Plant Cell，13，1063-1078.
非专利文献11：Michaels and Amasino 1998，The Plant Journal 14(3)p.381-385.
非专利文献12：Neff et al.1998，The plant Journal 14(3)p.387-392.
非专利文献13：Komari，T.，Saito，Y.，Nakakido，F.，and Kumashiro，T.(1989).Efficient selection of somatic hybrids in Nicotiana tabacum L.using acombination of Drug-resistance markers introduced by transformation.Theor.Appl.Genet.77，547-552.
非专利文献14：Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.，andLipman，D.J.(1990).Basic local alignment search tool.J.Mol.Biol.215，403-410.
非专利文献15：Komori，T.，Yamamoto，T.，Takemori，N.，Kashihara，M.，Matsushima，H.，and Nitta，N.(2002).Fine mapping of a restorer gene，Rf-1，thatrestores the BT-type cytoplasmic male sterility.Breed.Res.4(Suppl.2)，243.
非专利文献16：Harushima，Y.，et al.(1998).A high-density rice geneticlinkage map with 2275 markers using a single F2 population.Genetics 148，479-494.
非专利文献17：Kariya，K.(1989).Sterility caused by cooling treatment atthe flowering stage in rice plants III.Establishment of a method of in vitro pollengermination.Jap.J.Crop Sci.58，96-102.
发明内容
发明要解决的课题
本发明的目的在于提供具有高育性的杂交植物。本发明的杂交植物的特征是：在没有完全连锁关系的2个或更多的基因位点具有2拷贝或更多拷贝的育性恢复基因。
在本发明中，所说的“没有完全连锁关系的基因位点”优选不同的染色体上的基因座位。
在本发明中，育性恢复基因优选配子体型育性恢复基因，更加优选水稻(rice)的BT型雄性不育恢复基因。
本发明的目的还在于提供杂交植物的制备方法：包含通过基因工程学导入育性恢复基因，并使2拷贝或更多拷贝的育性恢复基因配置在没有完全连锁关系的2个或更多的基因位点的上述杂交植物的制备方法。
解决课题的手段
本发明者们为了解决上述课题，进行了深入而又广泛地研究，成功地获得了具有高育性的杂交植物，从而最终完成了本发明。
杂交植物
因此，本发明提供具有高育性的杂交植物。本发明的杂交植物的特征是在没有完全连锁关系的2个或更多的基因位点上具有2拷贝或更多拷贝的育性恢复基因。
在植物中，在形成作为配子体的花粉时产生减数分裂，各同源染色体对发生分离。因此，如果利用配子体型育性恢复基因和雄性不育细胞质培育杂交品种，由于在杂交品种的药中，具有育性恢复基因的花粉和不具有的花粉分离成1∶1，因此，理论的花粉育性为50％。本发明的杂交植物，由于具有：a)具有2拷贝或更多拷贝的育性恢复基因；并且b)在没有完全连锁关系的2个或更多的基因位点上具有这些育性恢复基因这样的特征，因此，在通过减数分裂形成花粉时，具有在任一的染色体上存在配子体型恢复基因的可能性变高的优点。
具体地，例如，水稻具有12对同源染色体，通过基因导入以及反复杂交，在例如第6、第7、第10染色体这3个地方配置了配子体型恢复基因。在形成花粉时，具有配子体恢复基因的同源染色体和不具有其的同源染色体对与其它的同源染色体对的分离独立地进行分离。因此，在3处具有配子体型育性恢复基因的花粉(第6、第7、第10染色体)、在2处具有的花粉(第6和第7、第6和第10或低7和第10)、在1处具有的花粉(第6、第7、第10的任意一个)、在0处具有的花粉以1∶3∶3∶1的比例形成。本研究者们明确了，基因工程学地导入的配子体型育性恢复基因与内因性基因同样地发挥功能、花粉即使具有1个配子体型育性恢复基因也可以得到育性、以及具有多个配子体型育性恢复基因的花粉可以正常地发育。因此，在理论上，除了完全不含有配子体型恢复基因的1/8比例的花粉以外，即，87.5％的花粉具有育性。在后述的实施例4中，显示了3位点Rf-1杂合子的花粉育性大概为87.5％，就是证明上述理论正确的实证。
以上，为了说明本发明的技术特征，举出了2拷贝或更多拷贝的育性恢复基因存在于不同的染色体上的情况作为例子。可是，在同一染色体上，即使存在多个，例如2个基因位点，如果两者存在某种程度的遗传距离，则与存在不同的染色体上的情况相同，可以独立地遗传。或者，即使不完全独立地遗传，只要行为不完全一起进行，就可以实现本发明的“通过在多拷贝基因位点配置2拷贝或更多拷贝的育性恢复基因，可以使花粉育性提高”这样的本发明的目的。因此，在本说明书中，所说的“没有完全连锁关系”不仅指基因位于不同的染色体上的情况和基因同样地完全独立地遗传的所谓“独立情况”，也包含虽然不是独立的但也不是完全连锁的“基因座存在紧密或适度连锁关系的情况”。虽然并不进行限定，但在2个基因位点存在约1cM或1cM以上，更加优选约5cM或5cM以上的距离时，两者进行没有行为完全一致遗传，也就是说“没有完全连锁关系”。
另外，对于孢子体型育性恢复基因，可以充分地认为，对于BT细胞质的育性恢复基因Rf-1显示了对WA细胞质的部分育性恢复能力。而且，通过配置多拷贝Rf-1，还具有提高恢复程度的可能性。现在，用于确认这点的实验正在进行。
本发明的杂交植物是在没有完全连锁关系的2个或更多基因位点具有2拷贝或更多拷贝的育性恢复基因的杂交植物，如上所述，与只具有1拷贝的育性恢复基因的育性恢复基因单位点杂合子(现有技术的杂交植物)相比较，具有高的花粉育性。另外，耐冷性，即，在低温条件下的种子育性也被提高(实施例7)。所说的“低温条件下”，是指例如，从移植后到成熟期，在20℃～28℃的光条件下、15℃～23℃的暗条件下进行栽培。例如，在后述的实施例7中，从移植后到成熟期，在光条件(24℃)12小时、暗条件(19℃)12小时下进行栽培时，本申请发明的杂交植物(FRコシヒカリ×16T1-35的F1)与只具有单拷贝的育性恢复基因的育性恢复基因单位点杂合子(MSコシヒカリ×FRコシヒカリ的F1)(现有技术的杂交植物)相比较，维持了高的种子育性。
本发明的杂交植物，包含花粉、种子、成体等所有的状态。
在本发明中对于得到的杂交植物的属、种没有特别限定，例如，包含水稻、玉米。特别优选水稻。
本发明的“育性恢复基因”包含配子体型和孢子体型两种。配子体型是由花粉的基因类型决定是否恢复花粉育性，已知有对于水稻的BT型雄性不育细胞质的育性恢复基因Rf-1和对于玉米的S型雄性不育细胞质的恢复基因。另一方面，孢子体型是由产生花粉的植物体的基因类型决定是否恢复花粉育性，已知有对于水稻的WA型雄性不育细胞质的育性恢复基因(Ahmedand Siddiq，1998)或对于玉米的T型雄性不育细胞质的育性恢复基因(Dhillon，1998)等。
已知的基因可以根据杂交植物的类型用作“配子体型育性恢复基因”。例如，杂交水稻的情况，可以利用水稻的BT型雄性不育性恢复基因Rf-1。对于Rf-1基因，本发明者们进行了分离·鉴定，并进行了专利申请。对于Rf-1基因，在本说明书中详细叙述。杂交玉米的情况，已知有对S型雄性不育细胞质的恢复基因，例如，在Wen，L.&Chase、C.D.(1999)Curr.Genet.35，p.521-526中所记载。
本发明的杂交植物含有2拷贝或更多拷贝的育性恢复基因。本发明利用了没有完全连锁关系的基因完全或部分独立地进行遗传的性质。因此，即使在多个育性恢复基因存在于同一染色体上时，也希望存在约1cM或1cM以上，更加优选约5cM或5cM以上的距离。最为优选基因的各拷贝存在于各种不同的染色体上。因此，育性恢复基因没有特别限定，但优选最大为染色体对数。
本发明的杂交植物在没有完全连锁关系的2个或更多基因位点具有2拷贝或更多拷贝的育性恢复基因。希望基因各拷贝分别存在于没有完全连锁关系的基因位点。但是，当具有3拷贝或3拷贝以上的多个基因时，即使其中的一部分存在于具有连锁关系的基因位点上时，当其他的基因存在于没有完全连锁关系的基因位点时，也可以得到比单拷贝拷贝(杂合的)时高的育性，这也包含在本发明的杂交植物中。例如，也包括含有4拷贝基因的杂交植物，并且其中的2个存在于同一染色体上的具有连锁关系的基因位点上，而另2个分别存在于其他的染色体上的情况。没有完全连锁关系的基因的数量越多，具有育性的花粉的概率就越高。理论上，在只存在1拷贝的育性恢复基因时为50％，而例如增加到2拷贝、3拷贝、4拷贝、5拷贝时，育性将高达75％、87.5％、93.75％、96.875％。在本发明的实施例4中，制作了最大在4基因位点具有育性恢复基因Rf-1的杂交水稻，并且观察到了极其接近于理论上的花粉育性93.75％的值。由此，显示了具有多个，例如4个育性恢复基因的花粉可正常地发育。因此，不必进行限定，但在本发明的杂交植物中，育性恢复基因的拷贝数优选2～宿主植物的染色体的对数，更加优选2～4。
另外，本发明的杂交植物中的2拷贝或更多拷贝的育性恢复基因中的之一可以是来自于天然地具有育性恢复基因的育性恢复系植物的。例如，已知水稻的Rf-1基因位点存在于第10染色体上(Fukuta et al.1992，Jpn J.Breed.42(supl.1)164-165)。这样的内因性育性恢复基因可以利用于本发明的杂交植物的培育中。
杂交植物的制作方法
本发明还提供一种提高育性的本发明的杂交植物的制作方法。本发明的方法包括：基因工程学地导入育性恢复基因，使2拷贝或更多拷贝的育性恢复基因配置在没有完全连锁关系的2个或更多的基因位点上。
虽然不必进行限定，但本发明的优选的方法包括：
1)通过基因工程学地导入育性恢复基因，产生在2位点或更多位点上纯合地具有育性恢复基因的育性恢复系的植物；
2)将工序1)制作的育性恢复系的植物与不育系的植物杂交的制作方法。
在1)工序中的向植物中导入育性恢复基因的方法没有特别限定，可以使用适应于植物种类的已知的方法。为了通过基因工程学的方法进行转导导入，可以使用任何适当的表达系统。重组表达载体包含适当的控制转录或翻译的核苷酸序列，例如，含有连接在来自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的核苷酸序列等上以使之可以发挥功能的可以导入到植物中的育性恢复基因(例如，水稻的Rf-1)的核酸。
在控制序列的例子中，包含转录启动子、操纵基因、或增强子、mRNA核糖体结合位点、以及调节转录以及翻译开始和结束的适当的序列。当控制序列在功能上与该DNA序列相关联时，核苷酸序列可以被连接成可以发挥该功能。因此，启动子核苷酸序列如果调节DNA序列的转录，该启动子核苷酸则可以功能性地连接在DNA序列上。在植物中，赋予复制能力的复制起点以及鉴定转化体的选择基因，通常并入到表达载体中。作为选择标记物，可以按照通常的方法使用通常使用的物质。可以举出，例如四环素、氨苄西林、或卡那霉素或新霉素、潮霉素或大观霉素等抗生物质抗性基因等。
另外，视需要，也可以在表达载体中排入编码适当的信号肽(天然或异源性)的序列。还可以使信号肽(分泌前导)的DNA序列框中(in flame)融合到核酸序列中，DNA首先被转录，然后mRNA被翻译成含有信号肽的融合蛋白质。
作为将基因的DNA片段插入到质粒等载体中的方法，可以举出，例如，Sambrook，J.，and Russell，D.W.(2001).Molecular Cloning：A LaboratoryManual，3rd ed.(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)中记载的方法等。简便地，还可以使用市售的连接反应药剂盒(例如，宝酒造制造等)。这样得到的重组载体(例如，重组质粒)可以导入到作为宿主细胞的植物中。
简便地，载体可以通过将目的基因按照通常的方法连接在可以在本领域获得的重组用载体(例如，质粒DNA等)上来制造。使用本发明的核酸片段对植物赋予育性时，植物转化用载体是特别有用的，作为植物用载体，只要是在植物细胞中表达该基因并具有生产该蛋白质的能力的载体，对其则没有特别限定，例如，可以举出pBI221、pBI121(以上为Clontech公司制造)以及从这些派生出来的载体。另外，特别是对于单子叶植物的转化，可以举出pIG121Hm、pTOK233(以上，Hiei等，Plant J.，6，270-282(1994))、pSB424(Komari等，Plant J.，10，165-174(1996))等。
转基因植物可以通过在上述载体的β-葡糖醛酸酶(GUS)基因位点替换为本发明的核酸片段来构筑植物转化用载体，并将其导入到植物中来进行调整。植物转化用载体优选至少含有启动子、翻译起始密码、目的基因(育性恢复基因的核酸序列或其一部分)、翻译终止密码以及终止子。另外，还可以适当含有编码信号肽的DNA、增强子序列、目的基因的5’侧以及3’侧的非翻译区域、选择标记物区域等。启动子、终止子只要是在植物细胞中发挥功能的物质，对其则没有特别限定，作为组成型表达的启动子，除了预先插入到上述载体中的35S启动子以外，还可以举出肌动蛋白、遍在蛋白基因的启动子等。
作为将质粒导入到宿主细胞中的方法，一般地，可以举出Sambrook，J.等(2001)(上述)中记载的磷酸钙法或氯化钙/氯化铷法、电穿孔法、电子注射法、PEG等通过化学处理的方法、使用基因枪的方法等。植物细胞时，可以通过例如叶盘(リ一フディスク)法[Science，227，129(1985)]、电穿孔法[Nature，319，791(1986)]来进行转化。
特别是，作为对植物的基因导入法，可以举出，使用土壤杆菌属的方法(Horsch et al.，Science，227，129(1985)、Hiet et al.，Plant J.，6，271-282(1994))、电穿孔法(Fromm et al.，Nature，319，791(1986))、PEG法(Paszkowski et al.，EMBO J.，3,2717(1984))、微注射法(Crossway et al.，Mol.Gen.Genet.，202，179(1986))、粒子轰击法(McCabe et al.，Bio/Technology，6，923(1988))等。只要是将核酸导入到希望的植物中的方法即可，没有特别限定。
虽然不作限定，但使用土壤杆菌属介导的植物(例如水稻)的恢复系的制作方法记载在例如，Hiel et al.，Plant J.，6，p.271-282(1994)、Komari et al.，PlantJ.，10，p.165-174(1996)、Ditta et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：p.7347-7351(1980)等中。
首先，制作希望的含有想要插入的核酸片断的质粒载体。质粒载体在上述Komari et al.，Plant J.，10，p.165-174(1996)等中记载了质粒图谱(プラスミドマツプ)，可以使用pSB11、pSB22等。或者本领域的技术人员还可以以例如pSB11、pSB22等质粒载体为基础，构筑各身的合适的载体。在本说明书后述的参考例中，以pSB11为基础制作并使用了具有潮霉素抗性基因盒的中间载体pSB200。具体地，首先将胭脂碱合成酶的终止子(Tnos)连接在遍在蛋白启动子和遍在蛋白内含子(Pubi-ubiI)上。在由此得到的Pubi-ubiI-Tnos连接体的ubiI-Tnos之间插入潮霉素抗性基因(HYG(R))，由此，得到含有Pubi-ubiI-HYG(R)-Tnos的连接体。通过将该连接体连接到pSB11(Komari等，如上述)的HindIII/EcoRI片断中，得到pKY205。在存在于该pKY205的Pubi上游的HindIII位点插入用于追加NotI、NspV、EcoRV、KpnI、ScaI、EcoRI限制酶位点的接头序列，得到具有潮霉素抗性基因盒的pSB200。
接着，使用含有插入核酸的重组载体转化大肠杆菌(例如，DH5α、JM109、MV1184等，任何一种都可以从例如TAKARA公司购入)。
另外，使用转化的大肠杆菌，优选将土壤杆菌菌株与辅助大肠杆菌菌株一起，按照例如Ditta et al(1980)的方法进行三亲杂交(triparential mating)。虽然没有限定，但土壤杆菌可以使用例如Agrobacterium tumefaciens菌株LBA4404/pBS1、LBA4404/pNB1、LBA4404/pBS3等。任何一种在上述的Komari et al.，Plant J.，10，p.165-174(1996)中记载了质粒图谱，本领域的技术人员可以通过进行例如构筑自载体而使用。虽然不作限定，但辅助大肠杆菌可以使用例如HB101/pRK2013(可以从クロ一ンテツク公司获得)。另外，虽然不是更加一般的，但也有报道可以使用具有pRK2073的大肠杆菌作为辅助大肠杆菌(Lemas et al.，Plasmid 1992，27，p.161-163)。
接着，使用希望的产生交配的土壤杆菌，基于例如Hiei et al(1994)的方法进行雄性不育植物、例如水稻的转化。转化所必要的水稻未成熟种子可以通过例如，对雄性不育水稻应用粳稻栽培种(japonica cultivar)的花粉授粉来制造。
转化植物的育性恢复可以在例如出穗约1个月后，通过植物群丛调查种子育性来进行调查。所谓植物群丛调查是以在圃场等中观察栽培状态的方法。或者也可以在实验室中进行调查穗的结实率的结实率调查。
从遗传工程学地导入育性恢复基因上，在2位点或更多的位点纯合地保有育性恢复基因的育性恢复系的植物的制作不作限定，例如，可以按照以下的方法进行。
首先，按照规定的方法，从用上述的方法进行了育性恢复的转化体提取DNA，并进行基因DNA分析。此时使用的探针由导入的基因片断的一部分制造。基于分析结果，筛选具有单拷贝插入的多个个体。接着，由各自的自交下一代对该导入基因选拔纯合的个体(以下，称为A个体和B个体)。选拔可以通过上述的基因DNA分析来进行，也可以通过基于导入了该基因的位点的周边碱基序列信息而设计的PCR标记来进行。从通过天然的恢复系×A的交配得到的杂交F2中选拔在2位点纯合地具有育性恢复基因的个体。来自天然的恢复系的育性恢复基因的基因型可以通过例如，WO 03/027290 A1中记载的方法推定。来自A个体的育性恢复基因的基因型如上所述，既可以通过基因DNA分析来推定，也可以通过PCR标记来推定。
按照同样的方法，从(天然的恢复系×A)×(天然的恢复系×B)的杂交F1中选拔纯合地具有来自天然的恢复系的育性恢复基因，并且杂合地具有来自A个体和B个体的育性恢复基因的个体。通过从选拔个体的繁殖下一代中选拔纯合地具有来自A个体和B个体的育性恢复基因的个体，可以制造在3位点纯合地具有育性恢复基因的个体。
另外，在各工序之前或之后，可以确认导入了外来基因的染色体的位置。导入基因染色体的位置的确认不作限定，可以按照例如下面的方法来进行。
与育性恢复基因一起，还可以在宿主植物中插入天然不存在的序列。例如，在后述的实施例中，与水稻的Rf-1基因一起，插入了胭脂碱合成酶的终止子(Tnos)(图9中的Nos)。另外，Tnos的序列包含在登录在公开数据库(基因库)的克隆载体pBI121(编号AF485783)中。在实施例3中，使用Nos来鉴定导入基因的染色体上的导入位点。具体地，制作基于已知的Nos的碱基序列的引物(例如，图9的NosF2)，进行PCR。分析得到的PCR扩增产物的末端碱基序列，对基因库的数据库进行同一性检索时，可知与水稻的特定的染色体的染色体组克隆的互补链序列(例如，图9的AP004007)一致。为了进一步确认导入基因存在于特定的染色体中，可以在上述特定的染色体上设计2个引物(例如，图9的No6F和No6R)，进行PCR。通过PCR，将存在导入基因的杂交植物的染色体组作为模板时，不能得到扩增产物，与此相反，不存在导入基因的植物染色体组，期望的长的片段被扩增。相反，将在导入基因的染色体位点的鉴定时使用的基于Nos碱基序列的单一的引物(例如，图9的NosF2)、和基于染色体上的序列的引物对的一个引物(例如，图9的Nos6R)作为引物对使用时，将存在导入基因的杂交植物的染色体组作为模板使用时，期望的长的片段被扩增，与此相反，不存在导入基因的植物染色体组没有观察到扩增产物。
在确认了染色体组的全体或一部分的碱基序列的植物中，可以利用上述确认方法。例如，对于水稻或玉米，在基因库、EMBL、DDBJ等数据库中公开了染色体组的碱基序列。
2)另外，通过将工序1)制造的育性恢复系的植物和不育系的植物进行交配，可以得到本发明的植物。
交配后，可以选择在没有完全连锁关系的2个或更多的基因位点具有2拷贝或更多拷贝的育性恢复基因的植物。在杂交植物中，存在2拷贝或更多拷贝的育性恢复基因，可以通过例如DNA分析(Southern)中的带数和/或浓度等来确认。
另外，本发明还包含工序1)中制作的在2个或更多的位点纯合地保有育性恢复基因的育性恢复系的植物。这样的育性恢复系植物在实际的育种现场，为了取得本发明的杂交植物，可以通过与希望的雄性不育系交配而使用。
对于水稻的BT型雄性不育细胞质的育性恢复基因Rf-1
本发明者们分离·鉴定了对于水稻的BT型雄性不育细胞质的育性恢复基因Rf-1(参考例)。在后述的实施例中，使用Rf-1基因作为配子体型育性恢复基因，制造杂交水稻。对于Rf-1基因，另外进行了专利申请。以下，详细叙述。
本发明者们的以前的申请
(特开2002-345485、WO 02/14506 A1)
(特愿2001-285247、特愿2001-309135以及特愿2001-185709、WO03/027290 A1)
(特愿2002-197560、PCT/JP03/03154)
本发明者们首先将Rf-1的存在位点限定为第10染色体上的极其狭窄的范围。基于其结果，开发了存在于Rf-1基因位点附近的PCR标记，发现了利用这些PCR标记与Rf-1基因位点连锁来检测出Rf-1基因的方法。具体地，利用Rf-1基因位点位于存在于水稻第10染色体上的PCR标记位点S12564Tsp509I位点和C1361 MwoI位点之间，并通过研究存在于附近的新型的PCR标记位点的基因型，来实施Rf-1基因有无的调查以及Rf-1基因纯合个体的选拔。基于该检测Rf-1基因的方法，本发明者们进行了专利申请(特愿2000-247204)、并作为特开2002-345485公开。另外，基于上述日本专利申请进行了国际申请(PCT/JP01/07052)，并作为WO 02/14506 A1被国际公开。这些申请的全部内容作为参考文献在本说明书中引用。
本发明者们还进一步限定含有Rf-1基因的Rf-1基因位点的区域作为特愿2000-247204的改良方法，申请了特愿2001-285247(2001年9月19日)、特愿2001-309135(2001年10月4日)以及特愿2002-185709(2002年6月26日)。而且，基于上述3个日本专利申请进行了国际专利申请(PCT/JP02/09429)。另外，本发明者们进一步进行研究，鉴定了Rf-1基因，并在2002年7月5日进行了专利申请(特愿2002-197560)。另外，基于上述日本专利申请进行了国际专利申请(PCT/JP03/03154)，并作为WO 03/027290A1公开。这些申请的全部内容作为参考文献在本说明书中引用。
在特开2002-345485中，本发明者们明确了Rf-1基因位点位于DNA标记位点S12564 Tsp509I和C1361 MwoI位点之间，并记载了利用其的RFLP-PCR用标记。本发明者们还对于DNA标记位点S12564 Tsp509I和C1361 MwoI位点之间的区域，通过以Rf-1基因位点和DNA标记位点S12564Tsp509I紧密连锁作为线索，进行染色体步查和遗传学的分析，来调查与Rf-1基因连锁的区域。其结果，含有Rf-1基因的Rf-1基因位点区域限定到约76kb，并且成功地测定了该区域的所有的碱基序列。
具体地，在特开2002-345485中，使用对MS越光交配MS-FR越光(对Rf-1位点杂合)的花粉而制作的1042个体的群体来进行连锁分析，发现了1个在Rf-1位点和S12564 Tsp509I位点之间的重组个体和2个在Rf-1位点和C1361 MwoI位点之间的重组个体。本发明者们进一步追加4103个个体到上述群体，成为合计5145个体并进行分析。其结果，新发现了1个在Rf-1位点和S12564 Tsp509I位点之间的重组个体和6个在Rf-1位点和C1361 MwoI位点之间的重组个体，使得各自的重组个体的总数为2个体和8个体。将这些10个体作为极其接近Rf-1位点的重组个体用于高精度分离分析(参考例1)。
Rf-1位点和S12564 Tsp509I位点之间的重组个体为2个体，与此相对，Rf-1位点和C1361 MwoI位点之间的重组个体为8个体这样的上述重组个体的出现频率，意味着如果比较S12564 Tsp509I位点和C1361 MwoI位点，S12564 Tsp509I位点在遗传学上与Rf-1位点接近。遗传距离(重组值cM为单位)和物理距离(碱基对数bp为单位)未必成比例，但通常希望如果遗传距离短，物理距离也短。
因此，通过以S12564 Tsp509I位点为起点进行染色体步查，可以分离Rf-1位点(参考例2)。在染色体步查时，使用籼稻栽培种(indica cultivar)IR24以及日本粳稻栽培品种(japonica cultivar)阿苏稔的染色体组DNA，通过λDASH II载体用于制作的基因组文库。IR24是携带Rf-1品种，阿苏稔是Rf-1非携带品种。进行染色体步查的结果，可以制作重叠群，其覆盖自IR24基因组克隆的约76kb的染色体区域(将多个克隆在重复部分重合，并排列化成染色体上的顺序)，测定了其全部碱基序列(76363bp)。
接着，通过利用得到的碱基序列信息等，重新开发12个标记物，使用已经叙述的极其接近Rf-1位点的10个重组个体，进行高精度分析(参考例3)。其结果显示了在上述约76kb的染色体区域中含有的65kb的序列包含决定Rf-1基因功能的有无的序列。该区域被由8个基因克隆构成的重叠群所重叠。各克隆的长度为约12～22kb，并具有至少4.7kb的重复部分。另一方面，对于稻基因的长度虽然已知有从短的到长的基因，但可以认为大部分基因为数个kb以内。因此，可以预测，这些8个基因克隆中，至少一个包含完全长度的Rf-1基因。
本发明者们为了直接地证明育性恢复能力的存在，在上述76kb的染色体区域中，进一步限定Rf-1基因区域，同时进行互补性试验。
具体地，通过遗传工程学技术分别地将上述76kb区域内的10个部分片段(各10～21kb)导入到雄性不育系的MS越光的未成熟种子(图5)。使用的10个部分片段中，8个为来自用前面的染色体步查得到的8个基因克隆(图1，参考例3中记载的XSE1、XSE7、XSF4、XSF20、XSG22、XSG16、XSG8以及XSH18)的片断。除此之外，还对2个来自克隆XSF18以及XSX1的片断也进行了互补性试验。XSF18与XSF20的5’末端和3’末端虽然(分别为序列号1的碱基20328和41921)相同，但缺少中间的碱基33947-38591。这是由于最初克隆XSF18虽然被分离，但判明在分离后的扩增过程中产生上述缺失，通过重新进行再次扩增，分离完全型的克隆，并命名为XSF20。另外，XSX1由于克隆XSG8和XSH18的重复部分稍小(约7kb)，通过限制酶处理以及连接反应从两克隆重新制作充分含有重复部分的克隆。
由于Rf-1是显性基因，在导入的片断完全包含Rf-1基因时，在导入植物原转化体(primary transformant)恢复了育性。在互补性试验中，对各片断进行导入植物的种子育性调查，并发现在导入了来自λ噬菌体克隆XSG16的15.6kb片断(含有序列号1的碱基38538-54123)的转化体中，恢复了种子育性(参考例4)。对于其他的片断，导入植物均为不育的。这些结果显示了上述15.6kb片断完全地包含Rf-1基因。另外，还提供了遗传工程学地导入Rf-1基因的方法，并证实了其有效性。
本发明者们为了进一步特定λ噬菌体克隆XSG16的哪一部分含有Rf-1基因，通过互补性试验对比上述的15.6kb片断(含有序列号1的碱基38538-54123)短的片断进行了种子育性调查。其结果发现，在导入了来自λ噬菌体克隆XSG16的11.4kb的片断(含有序列号1的碱基42357-53743)的转化体中，恢复了种子育性(参考例4(2))。另外，在导入了更短的6.8kb片断(含有序列号1的碱基42132-48883)的转化体中，恢复了种子育性(参考例4(3))。这些结果显示了上述6.8kb的片断完全地包含Rf-1基因。
本发明者们进一步进行研究，特定具有育性恢复功能的核酸，由此还明确了编码的氨基酸序列。具体地，如参考例5-6所记载，首先，使用PCR制作相应于序列号1的43733-44038以及48306-50226的DNA片断。将这样的2种片断作为探针(探针P和Q)，筛选由在越光中导入了Rf-1的系统而制作的cDNA文库。其结果，6个克隆的末端碱基序列与XSG16的序列一致，并分离作为含有Rf-1基因的克隆，分析碱基序列(序列号43-48)。
序列号43-48的任意一个序列都编码具有序列号49的氨基酸序列1-791的蛋白质。具体地，序列号43的碱基215-2587、序列号44的碱基213-2585、序列号45的碱基218-2590、序列号46的碱基208-2580、序列号47的碱基149-2521以及序列号48的碱基225-2597，任意一个都分别编码了序列号49的氨基酸序列1-791。另外，上述碱基序列对应于序列号1的碱基43907-46279。
将序列号49的氨基酸序列与玉米的育性恢复基因(Rf2)的推定氨基酸序列(Cui et al.，1996)比较时，N末端的7氨基酸残基(Met-Ala-Arg-Arg-Ala-Ala-Ser)一致。这些7氨基酸残基可以认为是对线粒体的靶信号的一部分(Liuet al.，2001)。由这些可以认为，这次分离的cDNA完全地包含Rf-1基因的重叠群区域。水稻Rf-1和玉米Rf2在氨基酸水平的同一性除了上述区域外，没有发现。
另外，这次分离的cDNA的序列与IR24的染色体组序列(序列号1)比较，明确了Rf-1基因的外显子和内含子(图7)。其结果，在植物体内，显示了剪接方式以及聚A附加位置不同的各种转录产物混合存在。在Rf-1基因的编码区域内，不存在内含子。
本发明者们在参考例4(3)的互补性试验中，对恢复了种子育性的6.8kb的片断还进行了互补性试验。具体地，在参考例7中，使用包含上述6.8kb片断的Rf-1基因的启动子区域和预计翻译区域的4.2kb片断(序列号1的碱基42132-46318)进行互补性试验时，恢复了种子育性。
另外，在参考例8中，重新取得6个包含具有育性恢复功能的核酸的克隆。具体地，首先，使用相当于序列号1的碱基45522-45545以及45955-45932的2种引物，以IR24的基因克隆XSG16为模板进行PCR，得到DNA片断。将该DNA片断作为探针R，与上述探针P一起进行噬菌斑杂交。从探针P以及探针R的任何一种都显示阳性的噬菌斑重新得到6个克隆(#7-#12)。其结果示于序列号54-59。
可以推定序列号54-59的任意一个序列都编码具有序列号49的氨基酸序列1-791的蛋白质。具体地，序列号54的碱基229-2601、序列号55的碱基175-2547、序列号56的碱基227-2599、序列号57的碱基220-2592、序列号58的碱基174-2546以及序列号59的碱基90-2462，任意一个都分别编码了序列号49的氨基酸序列1-791。另外，上述碱基序列对应于序列号1的碱基43907-46279。
通过将这次分离的cDNA的序列与IR24的染色体组序列(特愿2001-285247的序列号1比较，可以明确外显子和内含子的结构(图8)。在这次分离的cDNA中，不含有与预计翻译区域没有关系的外显子，存在3个包含单一的外显子的序列(#10-#12，序列号57-59)。
包含育性恢复基因(Rf-1)位点的核酸，是具有序列号1的碱基序列的核酸，或者与序列号1的碱基序列至少70％同一性的碱基序列，包含具有育性恢复功能的核酸。如参考例4所记载，序列号1的碱基序列中，可以确认，特别是在碱基38538-54123中，完全地含有Rf-1基因。另外，包含Rf-1基因的区域优选特定为序列号1的碱基38538-54123，进一步优选碱基42357-53743，更加优选碱基42132-48883，特别优选碱基42132-46318。
作为含有Rf-1的核酸，特定为以下的区域。
a)序列号43的碱基215-2587、
b)序列号44的碱基213-2585、
c)序列号45的碱基218-2590、
d)序列号46的碱基208-2580、
e)序列号47的碱基149-2521、
f)序列号48的碱基225-2597、
h)序列号54的碱基229-2601、
i)序列号55的碱基175-2547、
j)序列号56的碱基227-2599、
k)序列号57的碱基220-2592、
l)序列号58的碱基174-2546、和
m)序列号59的碱基90-2462。
上述碱基序列对应于g)序列号1的碱基43907-46279，而且，任意一个都编码序列号49的氨基酸序列1-791。
以下，在本说明书中，根据上下文的逻辑关系，“序列号1的碱基序列”这样的用语，表示序列号1全体或其一部分并参与育性恢复功能的部分，特别是碱基38538-54123。进一步优选表示42537-53743，更加优选表示42132-48883，特别优选表示碱基42132-46318。而且，特别优选表示g)序列号1的碱基43907-46279或与其对应的a)序列号43的碱基215-2587、b)序列号44的碱基213-2585、c)序列号45的碱基218-2590、d)序列号46的碱基208-2580、e)序列号47的碱基149-2521、f)序列号48的碱基225-2597、h)序列号54的碱基229-2601、i)序列号55的碱基175-2547、j)序列号56的碱基227-2599、k)序列号57的碱基220-2592、l)序列号58的碱基174-2546、m)序列号59的碱基90-2462。
在后述的参考例中，作为含有育性恢复基因(Rf-1)的核酸，从含有Rf-1基因的籼稻的IR24的染色体组文库分离核酸，并决定序列号1的碱基序列。可是，含有育性恢复基因(Rf-1)的核酸的来源，只要是具有Rf-1基因的来自籼型籼稻型品种的即可，没有特别限定。含有Rf-1基因的籼型籼稻品种，没有特别限定，包含例如，IR24、IR8、IR36、IR64、Chinsurah、BoroII。作为不具有Rf-1基因的粳型粳稻品种，不作特别限定，已知有例如，阿苏稔、越光、きらら397、秋光、ぬきたこまち、笹锦、キヌヒカリ、日本晴、初星、黄金晴、ヒノヒカリ、峰朝日(ミネアサヒ)、爱知香(ぬぃさのかおり)、初霜、曙、富士光、峰雪米(峰の雪もち)、九重米、ふくひびき，どんとこぃ、五百万石、花越前(ハナエチゼン)、轰鸣早生、はえぬき、どまんなか、山光(ヤマヒカリ)等。“籼型籼稻品种”和“粳型粳稻品种”都是本领域技术人员所公知的，本领域技术人员可以容易地判断何种水稻品种能够作为本发明的对象。
本发明中可以利用的核酸包含染色体组DNA(也包含其对应的cDNA)、化学合成的DNA、通过PCR扩增的DNA、以及这些的组合。
含有Rf-1的核酸，优选具有序列号1的碱基序列。有1个或1个以上的密码子编码相同的氨基酸的情况，被称为遗传密码的简并。因此，不与序列号1完全一致的DNA序列有时也可以编码具有与序列号1完全相同的氨基酸序列的蛋白质。这样的变异DNA序列既可以是由沉默(silent)突变(例如，在PCR扩增中产生)产生，或者是天然序列的有意的突变诱发的产物。
Rf-1基因优选编码在序列号49记载的氨基酸序列。可是，并不限定于这些，也可以具有1个或1个以上的氨基酸序列缺失、附加或取代的类似氨基酸序列。
只要具有育性恢复功能，可以含有全部同源的蛋白质。“氨基酸变异”为1个到多个，优选1～20个，更加优选1～10个，最为优选1～5个。编码Rf-1基因的氨基酸序列与序列号49记载的氨基酸序列具有至少约70％，优选80％或80％以上，更加优选90％或90％以上，特别优选95％或95％以上，最为优选98％或98％以上的同一性。
氨基酸的同一性比例可以通过视觉检查以及数学计算来决定。或者，2个蛋白质序列的同一性比例还可以通过基于Needleman，S.B.以及Wunsch，C.D.(J.Mol.Biol.，48：443-453，1970)的算法，并使用可以从威斯康辛大学遗传学计算机组织(UWGCG)获得的GAP计算机程序比较序列信息来决定。GAP程序的优选的设定系统参数中包含：(1)如Henikoff，S和Henikoff，J.G.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915-10919，1992)中记载的评分·矩阵，Blosum62；(2)12的间隙(ギヤツプ)罚分；(3)4的间隙长度罚分；和(4)对末端间隙没有罚分(penalty)。
还可以使用本领域技术人员使用的其他序列比较程序。同一性的比例可以使用例如Altschul等(Nucl.Acids.Res.25.，p.3389-3402，1997)中记载的BLAST程序与序列信息比较来决定。该程序可以从互联网上的国家生物技术信息中心(NCBI)或日本DNA数据库(DDBJ)的网址上使用。由BLAST程序进行的同一性检索的各种条件(参数)详细记载于同一网页上，可以适当变更一部分的设定，但检索通常使用设定的系统值来进行。
即使是具有相同功能的蛋白质，由于来源品种的不同，其氨基酸序列中存在不同，作为本领域的技术人员是周知的事实。Rf-1基因只要具有育性恢复功能，也可以包含序列号1的诸如剪辑序列这样的同系物、变异体。所谓“具有育性恢复功能”，是指在导入了该DNA片断时，对水稻个体或种子赋予育性的意思。育性恢复既可以依赖于由Rf-1基因来表达蛋白质，或者也可以是Rf-1基因的核酸(DNA或RNA)自身对赋予育性带来一些功能。
虽然不作限定，但Rf-1基因的同一体、变异体是否具有育性恢复功能可以如以下的方法来进行调查。得到通过对MS越光(不育系)交配越光的花粉而得到的未成熟种子，并按照Hiei et al(Plant Journal(1994)，6(2)，p.272-282)的方法，导入被检测核酸片断。如果将得到的转化体在通常的条件下栽培，被检测的核酸片断只在具有育性恢复功能时，种子结实。
来自于不具有Rf-1基因的粳型粳稻的阿苏稔的对应区域的核酸具有序列号2所示的碱基序列。序列号2和序列号1对应的部分作为全体具有约98％的同一性。因此，含有育性恢复基因(Rf-1)位点的核酸与序列号1具有至少约70％，优选80％或80％以上，更加优选90％或90％以上，特别优选95％或95％以上，最为优选98％或98％以上的同一性。“序列号1”特别优选g)序列号1的碱基43907-46279或与其对应的a)序列号43的碱基215-2587、b)序列号44的碱基213-2585、c)序列号45的碱基218-2590、d)序列号46的碱基208-2580、e)序列号47的碱基149-2521、f)序列号48的碱基225-2597、h)序列号54的碱基229-2601、i)序列号55的碱基175-2547、j)序列号56的碱基227-2599、k)序列号57的碱基220-2592、l)序列号58的碱基174-2546、或者m)序列号59的碱基90-2462的任意一个。
核酸的同一性比例可以通过视觉检查以及数学计算来决定。或者，2个核酸序列的同一性比例还可以通过Devereux等，Nucl.Acids Res.，12：387(1984)中所记载，使用可以从威斯康辛大学遗传学计算机组织(UWGCG)获得的GAP计算机程序6.0版本，比较序列信息来决定。GAP程序的优选的设定系统参数中包含：(1)关于核苷酸的单一(unary)比较矩阵(包含对同一性为1以及对非同一性为0的值)、以及如Schwartz和Dayhoff主编，蛋白质序列和结构图集(Atlas of Protein Sequence and Structure)，NationalBiomedical Research Foundation，pp.353-358(1979)中记载的，Gribskov和Burgess，Nucl.Acids Res.14：6745(1986)的加权(weight)比较矩阵；(2)对于各间隙3.0的罚分以及对于各间隙中的各记号进一步罚分0.10；以及(3)对于末端间隙没有罚分。还可以使用本领域技术人员使用的序列比较的其他的程序。
本发明的优选的核酸可以在中等程度严谨条件下与序列号1的碱基序列杂交，并且，可以在高度严谨条件下与具有育性恢复功能的核酸以及序列号1的碱基序列杂交，并且包含具有育性恢复功能的核酸。
如本发明中所使用的中等程度的严谨条件，具有一般技术的本领域的技术人员可以基于例如DNA的长度容易地决定。基本条件示于Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Vol.1，pp.1.101-104，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)中。例如，关于硝基纤维素滤膜，包含使用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的前洗涤预洗溶液、在约40℃～60℃的1×SSC～6×SSC(或者在约42℃的约50％甲酰胺中的例如斯塔克溶液(Stark’s solution)等其他的类似的杂交溶液)的杂交条件、以及约60℃、0.5×SSC、0.1％SDS的洗涤洗涤条件。另外，例如，当杂交溶液含有约50％甲酰胺时，上述杂交温度低达约15℃～20℃。高度严谨条件，本领域的技术人员也可以基于例如DNA的长度容易地决定。一般地，高度严谨条件与上述中等程度严谨条件相比，包含更高温度和/或更低盐浓度下的杂交和/或洗涤条件，例如，包含在约60℃～65℃的1×SSC～0.2×SSC的杂交条件和/或约65℃～68℃、0.2×SSC、0.1％SDS的洗涤条件。本领域的技术人员认识到，根据探针长度等主要因素，还可以视需要调整温度和洗涤溶液盐浓度。
“序列号1”特别优选g)序列号1的碱基43907-46279或与其对应的a)序列号43的碱基215-2587、b)序列号44的碱基213-2585、c)序列号45的碱基218-2590、d)序列号46的碱基208-2580、e)序列号47的碱基149-2521、f)序列号48的碱基225-2597、h)序列号54的碱基229-2601、i)序列号55的碱基175-2547、j)序列号56的碱基227-2599、k)序列号57的碱基220-2592、l)序列号58的碱基174-2546、m)序列号59的碱基90-2462的任意一个。
同样地，本发明的核酸包含由于1个或多个碱基缺失、插入或置换而与序列号1的碱基序列不同，但具有育性恢复功能的核酸。只要具有育性恢复功能，对缺失、插入或置换的碱基的数目没有特别限制，但优选1个到几千个，较为优选1个到1千个，更加优选1个到500个，特别优选1个到200个，最为优选1个到100个。
基于本发明的记载，Rf-1基因被进一步限定，本领域的技术人员可以除去Rf-1基因以外的部分或Rf-1基因内的内含子部分等的核酸而使周。另外，也可以由例如具有同样的物理化学特性的残基置换既定的氨基酸(特别是序列号49种记载的氨基酸序列)。这样保守置换的例子包含互相置换1个脂肪族残基，例如将Ile、Val、Leu或Ala互相置换；从Lys和Arg、Glu和Asp、或Ala和Asn间的1个极性残基置换为其他的残基；或芳香族残基用其他的残基置换，例如，Phe、Trp或Tyr互相置换的。其他的保守置换，例如具有类似的疏水性特性的区域全体的置换也是周知的。本领域的技术人员可以按照周知的遗传工程学的手法，使用Sambrook等(2001)(上述)等记载的，例如位点特异突变法，实施希望的缺失、插入或置换。
本发明者们将具有Rf-1基因的籼型IR24(碱基序列27)、不具有Rf-1基因的粳型的阿苏稔(碱基序列28)以及在基因库中注册的日本晴BAC克隆(编号AC068923)进行了比较。其结果发现，具有Rf-1基因的籼型的Rf-1区域至少具有以下的1个单碱基多态性(SNP)。
1)相应于序列号1的碱基1239的碱基为A；
2)相应于序列号1的碱基6227的碱基为A；
3)相应于序列号1的碱基20680的碱基为G；
4)相应于序列号1的碱基45461的碱基为A；
5)相应于序列号1的碱基49609的碱基为A；
6)相应于序列号1的碱基56368的碱基为T；
7)相应于序列号1的碱基57629的碱基为C；以及
8)相应于序列号1的碱基66267的碱基为G。
因此，含有本发明的Rf-1区域的核酸，优选满足上述条件1)～8)的1个到全部。
另外，在后述的参考例3中，对于Rf-1基因及其接近的重组个体(RS1-RS2、RC1-RC8)，研究了其Rf-1区域的染色体结构。其结果明确了，在序列号1的碱基1239～66267的碱基序列，即，即使最大限地估计，也在从P4497 MboI位点到B56691 XbaI位点的区域(约65kb)(图3)，包含决定有无Rf-1基因功能的序列。但是，Rf-1基因的一部分的基因型为籼型对Rf-1基因的基因功能表达是重要的，剩余的部分为粳型、籼型，可能都不会对基因功能产生大的差别。极端的情况，在粳型·籼型间编码区域完全相同，只是启动子区域有差别，而且，启动子区域和编码区域的一部分有时也可以只包含在从上述P4497 MboI位点到B56691 XbaI位点的区域(约65kb)中。因此，不能断定上述共有籼型区域(序列号1的碱基1239～66267)完全包含Rf-1基因全体。可是，通过以下的理由：
1)基因的大小通常为几个kb，超过10kb是稀少的；
2)IR24的染色体组碱基序列(序列号1)完全包含上述共有籼型区域；
3)序列号1的5’末端位于从上述共有籼型区域的5’末端到1238bp上游，是其他的基因(S12564)的一部分；以及
4)序列号1的3’末端位于从上述共有籼型区域的3’末端到10096bp下游，
可以认为，至少序列号1完全包含Rf-1基因全体。
另外，本发明者们通过进行互补性试验。确认了序列号1的碱基序列中，特别是在碱基38538-54123中，完全含有Rf-1基因。因此，在本发明的一实施方案中，与序列号1的碱基序列或序列号1的碱基38538-54123的碱基序列至少70％相同的碱基序列满足以下的条件1)以及2)的至少一个：
1)相应于序列号1的碱基45461的碱基为A；以及
2)相应于序列号1的碱基49609的碱基为A。
本发明者们还将作为含有Rf-1基因的核酸限定为以下区域。
a)序列号43的碱基215-2587、
b)序列号44的碱基213-2585、
c)序列号45的碱基218-2590、
d)序列号46的碱基208-2580、
e)序列号47的碱基149-2521、
f)序列号48的碱基225-2597、
h)序列号54的碱基229-2601、
i)序列号55的碱基175-2547、
j)序列号56的碱基227-2599、
k)序列号57的碱基220-2592、
l)序列号58的碱基174-2546、
m)序列号59的碱基90-2462。
上述碱基序列对应于g)序列号1的碱基43907-46279。本发明的优选的核酸还包含：
n)与上述a)～m)的任何一个核酸至少70％相同，并且具有育性恢复功能的核酸；
o)在中等程度或高程度严谨条件下与上述a)～m)的任何一个核酸杂交，并且具有育性恢复功能的核酸；
p)在上述a)～m)的任何一个核酸中，1个到多个碱基缺失、插入或置换，并且具有育性恢复功能的核酸。
上述序列号1的碱基45461相应于1)序列号43的碱基1769；2)序列号44的碱基1767；3)序列号45的碱基1772；4)序列号46的碱基1762；5)序列号47的碱基1703；6)序列号48的碱基1779；7)序列号54的碱基1783；8)序列号55的碱基1729；9)序列号56的碱基1781；10)序列号57的碱基1774；11)序列号58的碱基1728；12)序列号59的碱基1644。因此，特别优选在本发明方法中使用的核酸优选满足以下的条件1)～12)中的至少一个。
1)相应于序列号43的碱基1769的碱基为A；
2)相应于序列号44的碱基1767的碱基为A；
3)相应于序列号45的碱基1772的碱基为A；
4)相应于序列号46的碱基1762的碱基为A；
5)相应于序列号47的碱基1703的碱基为A；
6)相应于序列号48的碱基1779的碱基为A；
7)相应于序列号54的碱基1783的碱基为A；
8)相应于序列号55的碱基1729的碱基为A；
9)相应于序列号56的碱基1781的碱基为A；
10)相应于序列号57的碱基1774的碱基为A；
11)相应于序列号58的碱基1728的碱基为A；或
12)相应于序列号59的碱基1644的碱基为A。
在本说明书中的参考例4和7中记载的互补性试验中，实际上使用图5记载的10个来自克隆的片断，并通过使用土壤杆菌的方法转化MS越光(具有BT细胞质，核基因与越光基本上相同)。其结果证明了，通过含有序列号1的碱基38538-54123，优选碱基42357-53743、更加优选碱基42132-48883、特别优选碱基42132-46318的碱基序列的核酸，可以培育育性恢复系。
在本发明的实施例中，确认了使用来自于XSG16的15.6kb的片断作为Rf-1基因，可以得到花粉育性。也可以同样地利用含有该片断的更长的片断以及如上所述的鉴定了含有Rf-1基因的更短的片断，这是本领域的技术人员能够容易地理解的。优选利用更短的片断。
附图说明
[图1]图1显示了以RFLP标记位点S12564为起点的染色体步查的结果。
[图2]图2显示了BAC克隆AC068923和λ克隆重叠群的位置关系。
[图3]图3是显示基于从Rf-1位点的极其附近的重组型花粉(都具有育性)产生的10个体(RS1、RS2、RC1-8)的标记位点的基因型来明确该花粉的Rf-1位点极其附近的染色体结构的图。空白部分表示粳型区域，黑色部分表示籼型区域。
[图4]图4是基于第10染色体上的标记位点和Rf-1位点的连锁分析的结果显示Rf-1位点在连锁图上的位置的图。图距由1042F1个体的分离数据算出。
[图5]图5显示为了通过互补性试验鉴定Rf-1区域而使用的10个来自染色体组克隆的片断。使用通过染色体步查而得到的λ克隆(细线)，对粗的直线表示的染色体区域进行互补性试验。由于可知XSF18含有缺失的克隆，因此，其缺失部分用点线表示。
[图6]图6显示使用了来自XSG16的15.7kb(参考例4)和来自XSF18的16.2kb片断(包含序列号1的碱基21065-33946和38592-41921)的互补性试验的结果。来自XSG16的15.7kb恢复了育性，稻穗下垂。
[图7]图7显示Rf-1基因结构的模式图。白棒部分以及黑线部分分别表示外显子和内含子。对于外显子部分，显示了碱基对数。
[图8]图8显示了从进行互补性试验的IR24染色体组片断、用于cDNA库筛选的探针和分离的cDNA推定Rf-1基因的位置关系的模式图。Rf-1基因的白棒部分以及黑线部分分别表示外显子和内含子。对于外显子部分，显示了碱基对数。
[图9]图9是表示为了确认导入的Rf-1位点而使用的启动子的位置的模式图。Nos：胭脂碱合成酶的终止子(Tnos)、HPT：潮霉素抗性基因、BR：右缘、BL：左缘。
[图10]图10是显示本发明和现有技术的杂交植物的制作方法的例子的模式图。
实施例
以下，通过实施例具体地说明本发明，但这些并不是用于限定本发明的技术范围的。本领域的技术人员基于本说明书的记载可以容易地对本发明进行修饰·变更，这些也包含在本发明的技术范围中。
参考例
以下的参考例记载了水稻的BT型雄性不育性恢复基因Rf-1的分离·鉴定、育性恢复的确认。
参考例1 接近Rf-1位点重组个体的获得
(材料和方法)
使用向MS越光(世代：BC10F1)授粉于MS-FR越光(世代：BC9F1，与Rf-1位点异型)而制作的BC10F1群体4103个体，从各个体提取DNA，用特开2002-345485(或WO02/14506)记载的方法调查S12564 Tsp509I位点以及C1361 MwoI位点的基因型。将具有在S12564 Tsp509I位点的基因型的越光型纯合个体看作是通过在Rf-1位点和S12564 Tsp509I位点之间重组产生的个体，而具有在C1361 MwoI位点的基因型的越光型纯合个体看作是通过在Rf-1位点和C1361 MwoI位点之间重组产生的个体。
(结果和考察)
调查4103个体的结果，发现1个在Rf-1位点和S12564 Tsp509I位点之间的重组个体、6个在Rf-1位点和C1361 MwoI位点之间的重组个体。另一方面，在特开2002-345485(或WO02/14506)中，调查通过交配得到的1042个体的结果发现1个在Rf-1位点和S12564 Tsp509I位点之间的重组个体、2个在Rf-1位点和C1361 MwoI位点之间的重组个体(表3)。
如果合计，从5145个体可以获得2个在Rf-1位点和S12564 Tsp509I位点之间的重组个体、8个在Rf-1位点和C1361 MwoI位点之间的重组个体。将这10个体用于以下的参考例中的高精度分离分析。
参考例2染色体步查
(1)第1次染色体步查
(材料和方法)
使用日本品种阿苏稔(Rf-1非携带品种)的染色体组DNA，如特开2002-345485(或WO02/14506)所记载，通过Lambda DASH II载体制作基因库，用于染色体步查。
对于RFLP探针S12546的部分碱基序列(编号D47284)，设计下面的引物对：
5’-atcaggagccttcaaattgggaac-3’(序列号3)以及
5’-ctcgcaaattgcttaattttgacc-3’(序列号4)，
使用阿苏稔全部DNA为模板，按照规定的方法进行PCR。将得到的约1200bp的扩增产物进行琼脂糖凝胶的电泳后，使用QIAEXII(QIAGEN公司)进行纯化。纯化的DNA使用rediprime DNA labeling systen(Amersham Pharmacia公司)进行标记，并作为库筛选用探针(探针A，图1)。
库的筛选是在将噬菌斑印迹在Hybond-N+(Amersham Pharmacia公司)上后，按照通常的方法进行。分离单一噬菌斑后，使用Lambda Midikit(QIAGEN公司)，通过平板裂解法纯化噬菌体DNA。
(结果和考察)
通过筛选得到4个克隆，从末端碱基序列的分析和限制酶片断长度分析的结果，显示了其中的二个(WSA1和WSA3)存在图1所示的位置关系。通过引物步查，决定了对应于WSA1和WSA3的阿苏稔染色体组碱基序列(DNA序列377，ABI公司)。
(2)第2次染色体步查
(材料和方法)
除了已经叙述的阿苏稔基因库以外，还将由籼稻品种IR24(Rf-1携带品种)的染色体组DNA同样地制作IR24基因库用于染色体步查。
对于在(1)中明确的阿苏稔染色体碱基序列，设计下面的引物对：
5’-tgaaggagttatgggtgcgtgacg-3’(序列号5)以及
5’-ttgccgagcacacttgccatgtgc-3’(序列号6)，
使用WSA3的DNA为模板，按照规定的方法进行PCR。将得到的约524bp的扩增产物按照已经叙述的方法进行纯化·标记，并作为库筛选用探针(探针E，图1)。
库的筛选以及噬菌体DNA的纯化用已经叙述的方法进行。
(结果和考察)
通过阿苏稔基因库筛选得到15个克隆，从末端碱基序列的分析和限制酶片断长度分析的结果，显示了其中的一个(WSE8)存在图1所示的位置关系。通过引物步查，测定了对应于WSE8的阿苏稔染色体组碱基序列。
通过IR24基因库筛选得到7个克隆，从末端碱基序列的分析和限制酶片断长度分析的结果，显示了其中的二个(XSE1和XSE7)存在图1所示的位置关系。通过引物步查，测定了对应于XSE1和XSE7的IR24染色体组碱基序列。
(3)第3次染色体步查
(材料和方法)
将已经叙述的阿苏稔基因库以及IR24基因库用于染色体步查。
对于在(2)中明确的阿苏稔染色体碱基序列，设计下面的引物对：
5’-gcgacgcaatggacatagtgctcc-3’(序列号7)以及
5’-ttacctgccaagcaatatccatcg-3’(序列号8)，
使用WSE8的DNA为模板，按照规定的方法进行PCR。将得到的约1159bp的扩增产物按照已经叙述的方法进行纯化·标记，并作为库筛选用探针(探针F，图1)。
库的筛选以及噬菌体DNA的纯化用已经叙述的方法进行。
(结果和考察)
通过阿苏稔基因库筛选得到8个克隆，从末端碱基序列的分析和限制酶片断长度分析的结果，显示了其中的二个(WSF5和WSF7)存在图1所示的位置关系。通过引物步查，决定了对应于WSF5和WSF7的阿苏稔染色体组碱基序列。
通过IR24基因库筛选得到13个克隆，从末端碱基序列的分析和限制酶片断长度分析的结果，显示了其中的二个(XSF4和XSF20)存在图1所示的位置关系。通过引物步查，决定了对应于XSF4和XSF20的IR24染色体组碱基序列。
(4)第4次染色体步查
(材料和方法)
将已经叙述的阿苏稔基因库以及IR24基因库用于染色体步查。
对于在(3)中明确的阿苏稔染色体碱基序列，设计下面的引物对：
5’-aaggcatactcagtggagggcaag-3’(序列号9)以及
5’-ttaacctgaccgcaagcacctgtc-3’(序列号10)，
使用WSF7的DNA为模板，按照规定的方法进行PCR。将得到的约456bp的扩增产物按照已经叙述的方法进行纯化·标记，并作为库筛选用探针(探针G，图1)。
库的筛选以及噬菌体DNA的纯化用已经叙述的方法进行。
(结果和考察)
通过阿苏稔基因库筛选得到6个克隆，从末端碱基序列的分析和限制酶片断长度分析的结果，显示了其中的二个(WSG2和WSG6)存在图1所示的位置关系。通过引物步查，决定了对应于WSG2和WSG6的阿苏稔染色体组碱基序列。
通过IR24基因库筛选得到14个克隆，从末端碱基序列的分析和限制酶片断长度分析的结果，显示了其中的3克隆(XSG8、XSG16和XSG22)存在图1所示的位置关系。通过引物步查，决定了对应于XSG8、XSG16和XSG22的IR24染色体组碱基序列。
(5)第5次染色体步查
(材料和方法)
将已经叙述的IR24基因库用于染色体步查。
本发明者们阅览TIGR(The Institute for Genomic Research)的公开网页，发现包含RFLP标记S12564的BAC(Bacterial Artificial Chromosome)克隆(编号AC068923)已经在公开数据库(基因库)中注册。该BAC克隆是含有日本品种日本晴的染色体组DNA的物质，比较碱基序列时，显示完全包含(1)～(4)制作的阿苏稔以及IR24的重叠群区域(图2)。
因此，设计了下面的扩增该BAC克隆一部分的引物对：
5’-tggatggactatgtggggtcagtc-3’(序列号11)以及
5’-agtggaagtggagagagtagggag-3’(序列号12)，
使用IR24全部DNA为模板，按照规定的方法进行PCR。将得到的约600bp的扩增产物按照已经叙述的方法进行纯化·标记，并作为库筛选用探针(探针H，图1)。
库的筛选以及噬菌体DNA的纯化用已经叙述的方法进行。
(结果和考察)
通过IR24基因库筛选得到15个克隆，从末端碱基序列的分析和限制酶片断长度分析的结果，显示了其中的一个(XSH18)存在图1所示的位置关系。通过引物步查，决定了对应于XSH18的IR24染色体组碱基序列。
参考例3高精度分离分析
(1)PCR标记P4497 MboI的开发
将在参考例2中明确的对应于IR24重叠群的碱基序列(序列号1)和对应于阿苏稔重叠群的染色体组碱基序列(序列号2)进行比较的结果发现，序列号1的第1239个碱基为A，与此相对，对应于该位置的序列号2的第12631个碱基为G。
为了检测出该差异，首先使用下面的引物对：
P4497 MboI F：
5’-ccctccaacacataaatggttgag-3’(序列号13)
(相当于序列号1的碱基853-876)
(相当于序列号2的碱基12247-12270)
以及
P4497 MboI R：
5’-tttctgccaggaaactgttagatg-3’(序列号14)
(相当于序列号1的碱基1583-1560)
(相当于序列号2的碱基12975-12952)，
进行该位点周边的PCR扩增，扩增了约730bp的片断。将扩增产物MboI处理后，通过用琼脂凝胶进行电泳，可以可视化。即，由IR24DNA的扩增产物不具有MboI的识别序列(GATC)，不能通过MboI处理来切割，与此相反，由于由阿苏稔DNA的扩增产物具有MboI的识别序列，可通过MboI处理切割，因此，MboI处理后的DNA链长不同，可以作为琼脂凝胶中的移动的差异而被检测出来。
(2)PCR标记P9493 BslI的开发
将在参考例2中明确的对应于IR24重叠群的碱基序列(序列号1)和对应于阿苏稔重叠群的染色体组碱基序列(序列号2)进行比较的结果发现，序列号1的第6227个碱基为A，与此相对，对应于该位置的序列号2的第17627个碱基为G。
为了检测出该差异，首先使用下面的引物对：
P9493 BslI F：
5’-gcgatcttatacgcatactatgcg-3’(序列号15)
(相当于序列号1的碱基6129-6152)
(相当于序列号2的碱基17529-17552)
以及
P9493 BslI R：
5’-aaagtctttgttccttcaccaagg-3’(序列号16)
(相当于序列号1的碱基6254-6231)
(相当于序列号2的碱基17654-17631)，
进行该位点周边的PCR扩增，扩增了126bp的片断。将扩增产物BslI处理后，通过用琼脂凝胶进行电泳，可以可视化。即，由IR24DNA的扩增产物不具有BslI的识别序列(CCNNNNNNNGG)，不能通过BslI处理来切割，与此相反，由于由阿苏稔DNA的扩增产物具有BslI的识别序列，可通过BslI处理切割，因此，BslI处理后的DNA链长不同，可以作为琼脂凝胶中的移动的差异而被检测出来。
另外，在本标记物的开发时，使用了dCAPS法(Michaels and Amasino1998，Neff et al 1998)。具体地，通过上述P9493 BslI R引物的使用，序列号1的6236以及序列号2的17636的a置换为g。由此，来自阿苏稔DNA的片断的序列号2的17626-17636部分的序列成为CCtttccttGG，并通过BslI而被切割。
(3)PCR标记P23945 MboI的开发
将在参考例2中明确的对应于IR24重叠群的碱基序列(序列号1)和对应于阿苏稔重叠群的染色体组碱基序列(序列号2)进行比较的结果发现，序列号1的第20680个碱基为G，与此相对，对应于该位置的序列号2的第32079个碱基为A。
为了检测出该差异，首先使用下面的引物对：
P23945 MboI F：
5’-gaggatttatcaaaacaggatggacg-3’(序列号17)
(相当于序列号1的碱基20519-20544)
(相当于序列号2的碱基31918-31943)
以及
P23945 MboI R：
5’-tgggcggcagcagtggaggataga-3’(序列号18)
(相当于序列号1的碱基20778-20775)
(相当于序列号2的碱基32177-32154)，
进行该位点周边的PCR扩增，扩增了260bp的片断。将扩增产物MboI处理后，通过用琼脂凝胶进行电泳，可以可视化。即，由IR24DNA的扩增产物具有MboI的识别序列(GATC)，能够通过MboI处理来切割，与此相反，由于由阿苏稔DNA的扩增产物不具有MboI的识别序列，不能通过MboI处理切割，因此，MboI处理后的DNA链长不同，可以作为琼脂凝胶中的移动度的差异而被检测出来。
(4)PCR标记P41030 TaqI的开发
将在参考例2中明确的对应于IR24重叠群的碱基序列(序列号1)和对应于阿苏稔重叠群的染色体组碱基序列(序列号2)进行比较的结果发现，序列号1的第45461个碱基为A，与此相对，对应于该位置的序列号2的第49164个碱基为G。
为了检测出该差异，首先使用下面的引物对：
P41030 TaqI F：
5’-aagaagggagggttatagaatctg-3’(序列号19)
(相当于序列号1的碱基45369-45392)
(相当于序列号2的碱基49072-49095)
以及
P41030 TaqI R：
5’-atatcaggactaacaccactgctc-3’(序列号20)
(相当于序列号1的碱基45648-45625)
(相当于序列号2的碱基49351-49328)，
进行该位点周边的PCR扩增，扩增了280bp的片断。将扩增产物TaqI处理后，通过用琼脂凝胶进行电泳，可以可视化。即，由IR24DNA的扩增产物不具有TaqI的识别序列(TCGA)，不能通过TaqI处理来切割，与此相反，由于由阿苏稔DNA的扩增产物具有TaqI的识别序列，可通过TaqI处理切割，因此，TaqI处理后的DNA链长不同，可以作为琼脂凝胶中的移动度的差异而被检测出来。
(5)PCR标记P45177 BstUI的开发
将在参考例2中明确的对应于IR24重叠群的碱基序列(序列号1)和对应于阿苏稔重叠群的染色体组碱基序列(序列号2)进行比较的结果发现，序列号1的第49609个碱基为A，与此相对，对应于该位置的序列号2的第53311个碱基为G。
为了检测出该差异，首先使用下面的引物对：
P45177 BstUI F：
5’-acgagtagtagcgatcttccagcg-3’(序列号21)
(相当于序列号1的碱基49355-49378)
(相当于序列号2的碱基53057-53080)
以及
P45177 BstUI R：
5’-cagcgtgaaactaaaaacggaggc-3’(序列号22)
(相当于序列号1的碱基50166-50143)
(相当于序列号2的碱基53868-53845)，
进行该位点周边的PCR扩增，扩增了812bp的片断。将扩增产物BstUI处理后，通过用琼脂凝胶进行电泳，可以可视化。即，由IR24DNA的扩增产物具有2个BstUI的识别序列(CGCG)，可以通过BstUI处理切割成3个片断，与此相对，由阿苏稔DNA的扩增产物具有3个BstUI的识别序列，可通过BstUI处理切割成4个片断，因此，BstUI处理后的DNA链长不同，可以作为琼脂凝胶中的移动度的差异而被检测出来。
(6)PCR标记B60304 MspI的开发
将在参考例2中明确的对应于IR24重叠群的碱基序列(序列号1)和已经叙述的BAC克隆(编号AC068923)的碱基序列进行比较的结果发现，序列号1的第56386个碱基为T，与此相对，对应于该位置的AC068923的碱基为C。
为了检测出该差异，首先使用下面的引物对：
B60304 MspI F：
5’-atcccacatcatcataatccgacc-3’(序列号23)
(相当于序列号1的碱基56149-56172)
以及
B60304 MspI R：
5’-agcttctcccttggatacggtggcg-3’(序列号24)
(相当于序列号1的碱基56479-56455)
进行该位点周边的PCR扩增，扩增了约330bp的片断。将扩增产物MspI处理后，通过用琼脂凝胶进行电泳，可以可视化。即，由IR24DNA的扩增产物不具有MspI的识别序列(CCGG)，不能通过MspI处理来切割，与此相反，由日本晴DNA的扩增产物具有MspI的识别序列，可通过MspI处理切割，因此，MspI处理后的DNA链长不同，可以作为琼脂凝胶中的移动度的差异而被检测出来。
另外，在本标记物的开发时，使用了dCAPS法。具体地，通过上使用述B60304 MspI R引物，将序列号1的56463的g置换为t。由此，序列号1的56460-56463的MspI识别序列CCGG变为ccgt，变得不能通过MspI切割。因此，来自IR24的片断一个也没有MspI识别序列，另一方面，来自日本晴的DNA在对应于序列号1的56367-56370的区域具有1处MspI识别序列。
(7)PCR标记B59066 BsaJI的开发
将在参考例2中明确的对应于IR24重叠群的碱基序列(序列号1)和已经叙述的BAC克隆(编号AC068923)的碱基序列进行比较的结果发现，序列号1的第57629个碱基为C，与此相对，对应于该位置的AC068923的碱基为CC。
为了检测出该差异，首先使用下面的引物对：
B59066 BsaJI F：
5’-atttgttggttagttgcggctgag-3’(序列号25)
(相当于序列号1的碱基57563-57586)
以及
B59066 BsaJI R：
5’-gcccaaactcaaaaggagagaacc-3’(序列号26)
(相当于序列号1的碱基57983-57960)
进行该位点周边的PCR扩增，扩增了约420bp的片断。将扩增产物BsaJI处理后，通过用琼脂凝胶进行电泳，可以可视化。即，由IR24DNA的扩增产物不具有BsaJI的识别序列(CCNNGG)，不能通过BsaJI处理切割，与此相对，由日本晴DNA的扩增产物具有BsaJI的识别序列，可通过BsaJI处理切割，因此，BsaJI处理后的DNA链长不同，可以作为琼脂凝胶中的移动度的差异而被检测出来。
(8)PCR标记B56691 XbaI的开发
将在参考例2中明确的对应于IR24重叠群的碱基序列(序列号1)和已经叙述的BAC克隆(编号AC068923)的碱基序列进行比较的结果发现，序列号1的第66267个碱基为G，与此相对，对应于该位置的AC068923的碱基为C。
为了检测出该差异，首先使用下面的引物对：
B56691 XbaI F：
5’-cctcaagtctcccctaaagccact-3’(序列号27)
(相当于序列号1的碱基66129-66152)
以及
B56691 XbaI R：
5’-gctctactgctgataaaccgtgag-3’(序列号28)
(相当于序列号1的碱基66799-66776)
进行该位点周边的PCR扩增，扩增了约670bp的片断。将扩增产物XbaI处理后，通过用琼脂凝胶进行电泳，可以可视化。即，由IR24DNA的扩增产物不具有XbaI的识别序列(TCTAGA)，不能通过XbaI处理切割，与此相对，由日本晴DNA的扩增产物具有XbaI的识别序列，可通过XbaI处理切割，因此，XbaI处理后的DNA链长不同，可以作为琼脂凝胶中的移动度的差异而被检测出来。
(9)PCR标记B53627 BstZ17I的开发
将在参考例2中明确的对应于IR24重叠群的碱基序列(序列号1)和已经叙述的BAC克隆(编号AC068923)的碱基序列进行比较的结果发现，序列号1的第69331个碱基为T，与此相对，对应于该位置的AC068923的碱基为C。
为了检测出该差异，首先使用下面的引物对：
B53627 BstZ17I F：
5’-tggatggactatgtggggtcagtc-3’(序列号29)
(相当于序列号1的碱基68965-68988)
以及
B53627 BstZ17I R：
5’-agtggaagtggagagagtagggag-3’(序列号30)
(相当于序列号1的碱基69582-69559)
进行该位点周边的PCR扩增，扩增了约620bp的片断。将扩增产物BstZ17I处理后，通过用琼脂凝胶进行电泳，可以可视化。即，由IR24DNA的扩增产物具有BstZ17I的识别序列(GTAT)，可通过BstZ17I处理切割，与此相对，由日本晴DNA的扩增产物不具有BstZ17I的识别序列，不能通过BstZ17I处理切割，因此，BstZ17I处理后的DNA链长不同，可以作为琼脂凝胶中的移动度的差异而被检测出来。
(10)PCR标记B40936 MseI的开发
以下的(10)～(12)的PCR标记物的开发，任何一个都是关于相当于比序列号1的3’末端76363更加下游(3’末端)侧的碱基序列的研究。
对于已经叙述的BAC克隆(编号AC068923)的碱基序列，设计下面的引物对：
5’-tacgacgccatttcactccattgc-3’(序列号31)
以及
5’-catttctctatgggcgttgctctg-3’(序列号32)。
使用该引物对，将MS-FR越光(Rf-1位点的基因型为Rf-1 Rf-1)以及越光的全部DNA为模板，按照规定的方法进行PCR。将得到的约1300bp扩增产物用琼脂凝胶进行电泳后，使用QIAEXII(QIAGEN公司)进行纯化。将纯化的DNA碱基序列通过DNA序列377(ABI公司)进行分析的结果，可以在多处发现多态现象。
其中的一个，使用下面的引物对：
B40936 MseI F：
5’-acctgtaggtatggcaccttcaacac-3’(序列号33)
以及
B40936 MseI R：
5’-ccaaggaacgaagttcaaatgtatgg-3’(序列号34)
进行该位点周边的PCR扩增，将扩增产物MseI处理后，通过用琼脂凝胶进行电泳，可以可视化。即，由MS-FR越光(Rf-1 Rf-1)DNA的扩增产物具有MseI的识别序列(TTAA)，可通过MseI处理切割，与此相对，由越光DNA的扩增产物不具有MseI的识别序列，不能通过MseI处理切割，因此，MseI处理后的DNA链长不同，可以作为琼脂凝胶中的移动度的差异而被检测出来。
另外，在本标记物的开发时，使用了dCAPS法。
(11)PCR标记B19839 MwoI的开发
对于已经叙述的BAC克隆(编号AC068923)的碱基序列，设计下面的引物对：
5’-tgatgtgtttgggcatccctttcg-3’(序列号35)
以及
5’-gagataggggacgacagacacgac-3’(序列号36)。
使用该引物对，将MS-FR越光(Rf-1 Rf-1)以及越光的全部DNA为模板，按照规定的方法进行PCR。将得到的约1200bp扩增产物用琼脂凝胶进行电泳后，使用QIAEXII(QIAGEN公司)进行纯化。将纯化的DNA碱基序列通过DNA序列377(ABI公司)进行分析的结果，可以在多处发现多态现象。
其中的一个，使用下面的引物对：
B19839 MwoI F：
5’-tcctatggctgtttagaaactgcaca-3’(序列号37)
以及
B19839 MwoI R：
5’-caagttcaaacataactggcgttg-3’(序列号38)
进行该位点周边的PCR扩增，将扩增产物MwoI处理后，通过用琼脂凝胶进行电泳，可以可视化。即，由MS-FR越光(Rf-1 Rf-1)DNA的扩增产物不具有MwoI的识别序列(GCNNNNNNNGC)，不能通过MwoI处理切割，与此相对，由越光DNA的扩增产物具有MwoI的识别序列，可通过MwoI处理切割，因此，MwoI处理后的DNA链长不同，可以作为琼脂凝胶中的移动度的差异而被检测出来。
另外，在本标记物的开发时，使用了dCAPS法。
(12)PCR标记B2387 BfaI的开发
对于已经叙述的BAC克隆(编号AC068923)的碱基序列，设计下面的引物对：
5’-cactgtcctgtaagtgtgctgtgc-3’(序列号39)
以及
5’-caagcgtgtgataaaatgtgacgc-3’(序列号40)。
使用该引物对，将MS-FR越光(Rf-1 Rf-1)以及越光的全部DNA为模板，按照规定的方法进行PCR。将得到的约1300bp扩增产物用琼脂凝胶进行电泳后，使用QIAEXII(QIAGEN公司)进行纯化。将纯化的DNA碱基序列通过DNA序列377(ABI公司)进行分析的结果，可以在多处发现多态现象。
其中的一个，使用下面的引物对：
B2387 BfaI F：
5’-tgcctactgccattactatgtgac-3’(序列号41)
以及
B2387 BfaI R：
5’-acatactaccgtaaatggtctctg-3’(序列号42)
进行该位点周边的PCR扩增，将扩增产物BfaI处理后，通过用琼脂凝胶进行电泳，可以可视化。即，由MS-FR越光(Rf-1 Rf-1)DNA的扩增产物不具有BfaI的识别序列(CTAG)，不能通过BfaI处理切割，与此相对，由越光DNA的扩增产物具有BfaI的识别序列，可通过BfaI处理切割，因此，BfaI处理后的DNA链长不同，可以作为琼脂凝胶中的移动度的差异而被检测出来。
(13)分离分析
对于参考例1得到的2个Rf-1位点和S12564 Tsp509I位点之间的重组个体(RS1和RS2)以及8个Rf-1位点和C1361 MwoI位点之间的重组个体(RC1到RC8)，调查了上述(1)～(12)开发的12个DNA标记位点的基因型。其结果与各个体的S12564 Tsp509I位点以及C1361 MwoI位点的基因型一起示于表1。
[表1]
表1 Rf-1位点极其附近的重组个体的标记位点基因型
J：对越光是纯合的
H：对越光型/MS-FR越光型是杂合的
表1显示了，任意的个体在P9493 BslI到59066 BsaJI之间都具有来自籼型籼稻品种的Rf-1染色体区域。该结果显示了，具有如图3所示的染色体结构的重组型花粉中，具有花粉的生育能力，即，Rf-1基因发挥功能。这意味着在共有这些重组型花粉的籼型区域，即，即使最大限度估计也在P4497MboI位点到B56691 XbaI位点的区域(约65kb)中，含有决定Rf-1基因功能的有无的序列。
参考例4 关于来自XSG16的15.7kb片断的互补性试验
(1)
(材料和方法)
用NotI部分消化λ噬菌体克隆XSG16(图1和5)，并通过琼脂凝胶进行电泳。将分离的15.7kb的片断(包含序列号1的碱基38538-54123)使用QIAEXII(QIAGEN公司)纯化。
另一方面，以pSB11(Komari等，上述)为基础制作具有潮霉素抗性基因盒的中间载体pSB200。具体地，首先将胭脂碱合成酶的终止子(Tnos)连接在泛素启动子和泛素内含子(Pubi-ubiI)上。并通过将潮霉素体系基因(HYG(R))插入到由此得到的Pubi-ubiI-Tnos连接体的ubiI-Tnos之间，得到包含Pubi-ubiI-HYG(R)-Tnos的连接体。通过将该连接体连接在pSB11的HindIII/EcoRI片断上，得到pKY205。再通过将用于追加NotI、NspV、EcoRV、KpnI、SacI、EcoRI的限制酶位点的接头位点插入到存在于该pKY205 Pubi上游的HindIII位点，得到具有潮霉素抗性基因盒的pSB200。
用NotI完全消化上述质粒载体pSB200后，通过乙醇沉淀回收DNA。将回收的DNA溶解在TE溶液中后，通过CIAP(TAKARA公司)进行脱磷酸化。将反应液实施琼脂凝胶的电泳后，使用QIAEXII(QIAGEN公司)从凝胶纯化载体片断。
提供通过上述准备的来自XSG16的15.7kb片断和载体片断这二个片断，使用DNA Ligation Kit Ver.1(TAKARA公司)进行连接反应。反应后，通过乙醇沉淀回收DNA，将回收的DNA溶解在纯水(通过Millipore公司制造的装置制作)中后，与大肠杆菌DH5α混合，用于电穿孔。将电穿孔后的溶液用LB培养基进行振荡培养(37℃，1小时)后，铺展在含有大观霉素的LB板上，进行加温(37℃，16小时)。从生成的菌落中分离质粒。通过调查该限制酶片断长度模式以及分界部分的碱基序列，选拔通过重组质粒转化的希望的大肠杆菌。
提供通过上述选拔的大肠杆菌与Agrobacterium tumefaciens菌株LBA4404/pSB1(Komari et al，1996)以及辅助大肠杆菌HB101/pRK2013(Dittaet al，1980)，按照Ditta et al(1980)的方法进行三亲杂交。对于在含有大观霉素的AB板上产生的菌落中的6个，进行质粒分离，并通过调查限制酶片断长度模式来选拔希望的土壤杆菌。
使用通过上述选拔的土壤杆菌，基于Hiei et al(1994)的方法，进行MS越光(具有BT细胞质，核基因与越光几乎相同)的转化。转化所必需的MS越光的未成熟种子通过在MS越光上授于越光的花粉来制作。
转化植物顺应后，转移到长日照条件的温室中。培育到适合移植时期后，将48个体的植物移植到1/5000R的华格纳钵(4个体/钵)中，在移植3～4周后，转移到短日照条件的温室中。在出穗约1个月后，植物群丛调查种子育性。
(结果和考察)
导入植物47个体中，至少37个体明确地恢复了育性(图6)。由此可以认为，15586碱基(序列号1的碱基38538-54123)包含全部长度的Rf-1基因，其中该15586碱基是作为导入15.7kb片断中、来自于水稻(IR24)的部分。
(2)关于XSG16内部的11.4kb片断的互补性试验
(材料和方法)
用AlwNI和BsiWI完全消化λ噬菌体克隆XSG16后，通过乙醇沉淀回收DNA。将回收的DNA溶解在TE溶液中后，通过DNA BluntingKit(TAKARA公司)进行平滑化。将反应液进行琼脂凝胶电泳，并使用QIAEXII(QIAGEN公司)纯化分离的11.4kb的片断。
用SmaI完全消化质粒载体pSB11(Komari et al.Plant Journal，1996)，完全消化后，通过乙醇沉淀回收DNA。将回收的DNA溶解在TE溶液中后，通过CIAP(TAKARA公司)进行脱磷酸化。将反应液进行琼脂凝胶电泳后，使用QIAEXII(QIAGEN公司)从凝胶纯化载体片断。
提供通过上述制备的二个片断，使用DNA Ligation Kit Ver.1(TAKARA公司)进行连接反应。反应后，通过乙醇沉淀回收DNA，将回收的DNA溶解在纯水(通过Millipore公司制造的装置制作)中后，与大肠杆菌DH5α混合，用于电穿孔。将电穿孔后的溶液用LB培养基进行振荡培养(37℃，1小时)后，铺展在含有大观霉素的LB板上，进行加温(37℃，16小时)。对于生成的菌落中的14个，进行质粒分离，并通过调查该限制酶片断长度模式以及边界部分的碱基序列，选拔希望的大肠杆菌。
提供通过上述选拔的大肠杆菌与Agrobacterium tumefaciens菌株LBA4404/pSB4U(高仓等，特愿2001-269982(WO02/019803 A1))以及辅助大肠杆菌HB101/pRK2013(Ditta et al，1980)，按照Ditta et al(1980)的方法进行三亲杂交。对于在含有大观霉素的AB板上产生的菌落中的12个，进行质粒分离，并通过调查限制酶片断长度模式来选拔希望的土壤杆菌。
使用通过上述选拔的土壤杆菌，基于Hiei et al(1994)的方法，进行MS越光(具有BT细胞质，核基因与越光几乎相同)的转化。转化所必需的MS越光的未成熟种子通过在MS越光上授粉越光的花粉来制作。
转化植物顺应后，转移到长日照条件的温室中。培育到适合移植时期后，将120个体的植物移植到1/5000R的华格纳钵(4个体/钵)中，在移植约1个月后，转移到短日照条件的温室中。在出穗约1个月后，从各个体中取1穗标准的穗作为试样，调查种子育性(对于总稻谷数的结实稻谷的比例)。
(结果和考察)
导入植物120个体中，59个体显示10％或10％以上的种子育性，其中19个体显示70％或70％以上的种子育性。由此可以认为，作为导入了11.4kb片断(序列号1的从第42357个碱基到第53743个碱基)表现出育性恢复的功能，此外还包含必须的Rf-1基因区域。
(3)关于XSG16内部的6.8kb片断的互补性试验
(材料和方法)
用HpaI和AlwNI完全消化λ噬菌体克隆XSG16后，进行通过琼脂凝胶的电泳。使用QIAEXII(QIAGEN公司)纯化分离的6.8kb的片断。包含对于质粒载体pSB11的调整，以及以后的过程按照上述(2)记载的方法进行。
(结果和考察)
导入植物120个体中，67个体显示10％或10％以上的种子育性，其中26个体显示70％或70％以上的种子育性。由此可以认为，作为导入了6.8kb片断(序列号1的从第42132个碱基到第48883个碱基)表现出育性恢复的功能，此外还包含必须的Rf-1基因区域。
对于图1以及图5所示的来自阿苏稔的其他的片断，即，XSE1、XSE7、XSF4、XSF4、XSF18、XSF20、XSG22、XSG8、XSH18以及XSX1也进行了同样的试验，但任何一个都没有育性恢复功能。
参考例5 cDNA库的制作
首先，通过回交制作在越光中导入了Rf-1的系IL216(基因型为Rf-1/Rf-1)。用通常的方法温室栽培上述IL216，在叶耳间长为-5～5cm的生育阶段取样幼穗。用SDS-苯酚法(Watanabe，A.and Price，C.A.(1982)Translation of mRNAs for subunits of chiloroplast coupling factor 1 in spinach.Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A.，79，6304-6308)提取全RNA后，通过QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Amersham PharmaciaBiotech)纯化poly(A)+RNA。
接着，提供纯化的poly(A)+RNA，并通过ZAP-cDNA合成试剂盒(Stratagene)制作cDNA库。制作的库(1ml)的滴度算出为16000000pfu/ml，经判断是非常大的。
参考例6 cDNA库的筛选
(1)筛选用引物的制作
使用以下的2种引物：
有意义引物
5’-tctcattctctccacgccctgctc-3’(序列号50)
反义引物
5’-acggcggagcaattcgtcgaacac-3’(序列号51)，
以IR24的基因克隆XSG16作为模板进行PCR。序列号50以及51分别相当于序列号1的碱基43733-43756以及44038-44015。
电泳后，通过QIAEX II Gel Extraction Kit(QIAGEN)从琼脂凝胶回收约300bp的扩增产物。使用Rediprime II DNA labeling system(AmershamPharmacia Biotech)将回收的片断进行32p标记(以下，称为“探针P”)。
另外，使用以下的2种引物：
有意义引物
5’-agtgtgtggcatggtgcatttccg-3’(序列号52)
反义引物
5’-ctctacaggatacacggtgtaagg-3’(序列号53)，
以IR24的基因克隆XSG16作为模板进行PCR。序列号50以及52分别相当于序列号1的碱基48306-48329以及50226-50203。电泳后，通过上述方法从琼脂凝胶回收约1900bp的扩增产物。使用上述方法将回收的片断进行32P标记(以下，称为“探针Q”)。
(2)cDNA库的筛选
提供参考例5制作的cDNA库，制作70枚出现了约15000噬菌斑的琼脂培养基。对各琼脂培养基各进行2次噬菌斑リフト(plaque lift)，转录为Hybond-N+(Amersham Pharmacia Biotech)。将一个膜用于与探针P的杂交，另一个膜用于与探针Q的杂交。一系列的操作按照制造者的说明书进行。
杂交是在含有250mM Na2HPO4、1mM EDTA以及7％SDS的杂交溶液中添加探针，并在65℃下进行16小时。洗涤是通过含有1×SSC以及0.1％SDS的溶液在65℃、15分钟下进行2次后，再通过含有0.1×SSC以及0.1％SDS的溶液在65℃、15分钟下进行2次。将洗涤后的膜用FUJIX BAS1000(FujiPhoto Films)进行分析。
其结果，发现了8个用探针P和探针Q都显示阳性的噬菌斑。因此，分离这些噬菌斑，按照制造者(Stratagene)的说明书对pBluescript进行亚克隆后，调查末端碱基序列。8个克隆中，6个克隆的末端碱基序列与XSG16的序列一致。确定这些6克隆的全部碱基序列，其结果示于序列表的序列号43-74中。
推定序列号43-74的任意的序列都编码了具有序列号49的氨基酸序列1～791的蛋白质。具体地，序列号43的碱基215-2587、序列号44的碱基213-2585、序列号45的碱基218-2590、序列号46的碱基208-2580、序列号47的碱基149-2521以及序列号48的碱基225-2597，任意一个都分别编码了序列号49的氨基酸序列1-791。另外，上述碱基序列对应于序列号1的碱基43907-46279。
将序列号49的氨基酸序列与玉米的育性恢复基因(Rf2)的推定氨基酸序列(Cui et al.，1996)比较时，N末端的7氨基酸残基(Met-Ala-Arg-Arg-Ala-Ala-Ser)一致。这些7氨基酸残基可以认为是对线粒体的靶信号的一部分(Liuet al.，2001)。由这些可以认为，这次分离的cDNA完全地包含Rf-1基因的重叠群区域。没有发现除了上述区域外的水稻Rf-1和玉米Rf2在氨基酸水平的同一性。还推测了基因产物转移到线粒体上后的育性恢复原理，对于两者是不同的。
另外，通过将这次分离的cDNA的序列与IR24的染色体组序列(序列号1)比较，明确了外显子和内含子的结构(图7)。其结果，在植物体内，显示了剪接方式以及聚A附加位置不同的各种转录产物混合存在。
参考例7 互补性试验
在参考例4(3)中，使用质粒中的包含Rf-1基因的启动子区域和预计翻译区域的4.2kb片断，进行互补性实验，其中该质粒含有证明了具有育性恢复功能的来自IR24的6.8kb染色体组片断。
首先，用EcoRI处理上述参考例4(3)的质粒，并进行通过琼脂凝胶的电泳。分离包含Rf-1基因的启动子区域和预计翻译区域的4.2kb片断(相当于序列号1的碱基42132-46318)，使用QIAEXII(QIAGEN)从凝胶中回收。提供该4.2kb的片断与用EcoRI处理后CIAP(TAKARA)处理的pBluescriptIISK(-)，使用DNA Ligation Kit Ver.1(TAKARA公司)进行连接反应。反应后，通过乙醇沉淀回收DNA。
将回收的DNA溶解在纯水(通过Millipore公司制造的装置制作)中后，与大肠杆菌DH5α混合，用于电穿孔。将电穿孔后的溶液用LB培养基进行振荡培养(37℃，1小时)后，铺展在含有大观霉素的LB板上，进行加温(37℃，16小时)。对生成的菌落中的12个，进行质粒分离，并通过调查该限制酶片断长度模式以及分界部分的碱基序列，选拔希望的大肠杆菌。接着，将从选拔的大肠杆菌分离的质粒用BamHI和SalI处理后，进行通过琼脂凝胶的电泳，分离包含Rf-1基因的启动子区域和预计翻译区域的4.2kb片断，使用QIAEXII(QIAGEN)从凝胶中回收。
另一方面，将TnosJH0072(具有nos终止子和氨苄西林抗性基因盒的中间载体)用BamHI和SalI处理后，进行通过琼脂凝胶的电泳。分离包含nos终止子和氨苄西林抗性基因盒的3.0kb片断，使用QIAEXII(QIAGEN)从凝胶中回收。
将包含Rf-1基因的启动子区域和预计翻译区域的4.2kb片断和来自TnosJH0072的片断用上述的方法进行连接反应和电穿孔。铺展在含有氨苄西林的LB板上，加温(37℃，16小时)后，对生成的菌落中的12个，进行质粒分离，并通过调查该限制酶片断长度模式以及分界部分的碱基序列，选拔希望的大肠杆菌。
另外，将从如上述选拔的大肠杆菌分离的质粒用SgfI处理后，进行通过琼脂凝胶的电泳，分离包含Rf-1的启动子区域和预计翻译区域的4.2kb片断，使用QIAEXII(QIAGEN)从凝胶中回收。将该4.2kb的片断与PacI处理后CIAP(TAKARA)处理的pSB200Pac(具有潮霉素抗性基因盒的中间载体)一起提供，用上述的方法进行连接反应和电穿孔。铺展在含有大观霉素的LB板上，加温(37℃，16小时)后，对生成的菌落中的16个，进行质粒分离，并通过调查该限制酶片断长度模式以及分界部分的碱基序列，选拔希望的大肠杆菌。
通过以上的工序，在含有Rf-1的启动子区域和Rf-1的预计翻译区域的片断上连接了nos终止子的嵌合基因插入到中间载体内，得到大肠杆菌。提供该大肠杆菌与Agrobacterium tumefaciens菌株LBA4404/pSB1(Komari et al，1996)以及辅助大肠杆菌HB101/pRK2013(Ditta et al，1980)，按照Ditta etal(1980)的方法进行三亲杂交。对于在含有大观霉素的AB板上产生的菌落中的6个，进行质粒分离，并通过调查限制酶片断长度模式来选拔希望的土壤杆菌。
使用通过上述选拔的土壤杆菌，基于Hiei et al(1994)的方法，进行MS越光(具有BT细胞质，核基因与越光几乎相同)的转化。转化所必需的MS越光的未成熟种子通过在MS越光上授于越光的花粉来制作。
转化植物顺应后，转移到长日照条件的温室中。培育到适合移植时期后，将32个体的植物移植到1/5000R的华格纳钵(4个体/钵)中，在移植3～4周后，转移到短日照条件的温室中。在出穗约1个月后，植物群丛调查种子育性。其结果，可知32个体中的28个体恢复了育性。
从以上的结果，实验地证明了可以通过表达预想的翻译区域来赋予Rf-1基因的功能。
参考例8 cDNA分离
在参考例6中，通过探针P和探针Q筛选来自IR24幼穗的cDNA库，并通过分离·分析用任意的探针都显示阳性的噬菌斑，分离6个cDNA。在本参考例中，通过由探针P和下述的探针R进行同样的筛选，再分离6个cDNA。详细如下。
首先，使用2种引物：
有意义引物
5’-cagttgggttgaaacctaatactg-3’(序列号60)
反义引物
5’-cactaaaccgttagacgagaaagc-3’(序列号61)，
以IR24的基因克隆XSG16作为模板进行PCR。序列号60以及61分别相当于序列号1的碱基45522-45545以及45955-45932。
电泳后，通过QIAEX II(QIAGEN)从琼脂凝胶回收约430bp的扩增产物。使用Rediprime II DNA labeling system(Amersham Pharmacia Biotech)将回收的片断进行32p标记(探针R，图8)。
使用来自IR24幼穗的cDNA库，制作20枚出现了约15000噬菌斑的琼脂培养基。对各琼脂培养基各进行2次噬菌斑リフト，转录为Hybond-N+(Amersham Pharmacia Biotech)。将一个膜用于与参考例6的探针P的杂交，另一个膜用于与探针R的杂交。一系列的操作按照制造者的说明书进行。其结果，发现12个用探针P和探针R的任意一个都显示阳性的噬菌斑。
因此，分离这些噬菌斑，按照制造者(Stratagene)的说明书对pBluescript进行亚克隆后，调查末端碱基序列。由于12个克隆中，6个克隆的末端碱基序列与XSG16的序列一致，因此，决定这些6克隆的全部碱基序列(#7～#12)。其结果示于序列表的序列号54-85中。
推定序列号54-85的任意的序列都编码了具有序列号49的氨基酸序列1～791的蛋白质。具体地，序列号54的碱基229-2601、序列号55的碱基175-2547、序列号56的碱基227-2599、序列号57的碱基220-2592、序列号58的碱基174-2546以及序列号59的碱基90-2462，任意一个都分别编码了序列号49的氨基酸序列1-791。另外，上述碱基序列对应于序列号1的碱基43907-46279。
另外，通过将这次分离的cDNA的序列与IR24的染色体组序列(序列号1)比较，明确了外显子和内含子的结构(图8)。在这次分离的cDNA中，不含有与预想翻译区域没有关系的外显子，但存在3个含有单一外显子的序列(#10～＃12，序列号57-59)。
实施例1 单拷贝拷贝插入转化体的选拔
(材料和方法)
本发明者们发现，在参考例4(1)中，通过将来自IR24的基因克隆XSG16的15.6kb片断导入到MS越光(具有BT细胞质，核基因与越光基本上相同)，在转化当代(T0世代)恢复种子育性。
从恢复了种子育性的导入植物(T0世代)中选择12个体，通过SDS-苯酚法(Komari et al.，1989)从绿叶中提取全DNA。用SacI消化全DNA，实施琼脂糖电泳后，按照制造者的说明书转录为Hybond-N+(Amersham PharmaciaBiotech)，用于DNA分析。
用于DNA分析的探针，按照以下的方法制作。首先，使用2种引物：
5’-attgagggttgaacaatgatgggc-3’(序列号62)
(相当于序列号1的碱基49244-49267)
5’-ctctacaggatacacggtgtaagg-3’(序列号63)
(相当于序列号1的碱基50226-50203)，
以上述基因克隆XSG16作为模板进行PCR。电泳后，通过QIAEX II GelExtraction Kit(QIAGEN)从琼脂凝胶回收约980bp的扩增产物。使用RediprimeII DNA labeling system(Amersham Pharmacia Biotech)将回收的片断进行32P标记。
杂交是在含有250mM Na2HPO4、1mM EDTA以及7％SDS的杂交溶液中添加探针，并在65℃下进行16小时。洗涤是通过含有1×SSC以及0.1％SDS的溶液在65℃、15分钟下进行2次后，再通过含有0.1×SSC以及0.1％SDS的溶液在65℃、15分钟下进行2次。将洗涤后的膜用FUJIX BAS1000(FujiPhoto Films)进行分析。其他的实验方法参考实验手册(Sambrook等，2001，上述)进行。
SacI消化的结果，对于显示为单拷贝拷贝的个体的一部分，EcoRV消化后，与上述同样地进行DNA分析。
(结果和考察)
对12个体的SacI消化DNA分析的结果，除了对应于内源的rf-1基因的约12kb的带以外，还观察到各种大小的带。各个体的带数可认为反映该个体的导入复制数，因此，将只观察到1条除了约12kb的带以外的带的7个体作为导入单拷贝拷贝插入的个体候补。
从这些导入单拷贝拷贝的个体候补中选拔6个体，进行EcoRV消化DNA分析。其结果，对于任意的个体，除了对应于内源的rf-1基因的约15kb的带以外，还观察到1条带。以上的结果显示了，这些6个体是导入单拷贝拷贝的个体。
实施例2对于导入基因纯合个体的选拔
(材料和方法)
将实施例1中显示为单拷贝导入个体的6个体中的4个体(16T0-6、16T0-26、16T0-34、16T0-35)的自交下一代各栽培6个，用实施例1记载的方法提取全DNA，EcoRV消化后进行DNA分析。
(结果和考察)
通过在各系统内比较对应于内源rf-1基因的约15kb的带和对应于导入基因的带的强度，从各系中各选拔1个导入基因纯合个体(16T1-6、16T1-26、16T1-34、16T1-35)。用碘-碘化钾染色调查这4个体的花粉育性时，可知任何一个都接近于100％，从DNA分析的结果推定的导入基因位点的基因型显示为正确的。
实施例3导入基因的染色体位点的鉴定
(1)16T0-6的导入位点的鉴定
(材料和方法)
用PstI完全消化实施例1使用的16T0-6的DNA后，使用LAPCR in vitroCloning Kit(TAKARA)，按照制造者的说明书进行导入位点的扩增。在第1次的PCR中，使用
Nos F1：
5’-agattgaatcctgttgccggtcttgcgatg-3’(序列号64)
作为特异的引物。PCR条件为反复进行30次包括在94℃下处理2分钟后，在94℃下进行1分钟的热变性，在58℃下进行1分钟的退火，在72℃下进行2分钟的延伸反应的循环，最后，在72℃下处理2分钟。
第2次的PCR是以第1次的PCR反应溶液的200倍稀释液1μl为模板，使用Nos F2：
5’-tcatctatgttactagatccgatgataagc-3’(序列号65)
作为特异的引物。PCR条件与第1次相同。将第2次的PCR反应液进行琼脂凝胶电泳，并通过QIAEX II Gel Extraction Kit(QIAGEN)从琼脂凝胶回收扩增的产物，分析碱基序列。
(结果和考察)
将第2次的PCR反应液进行琼脂凝胶电泳，回收约500bp的片断。确定回收的片断的末端碱基序列，并对于基因库公开数据库进行BLAST检索(Altschul et al.，1990)。其结果，可知与日本晴的第6染色体的染色体组克隆(编号AP004007)的互补链序列一致。
因此，对于AP004007的互补链序列，在图9所示的位置设计了：
No6 F：
5’-acttcaactagcaccctctctcacct-3’(序列号66)
以及
No6 R：
5’-tctgctggttgaacatggtgtgatag-3’(序列号67)
2个引物。使用这些引物，以越光和实施例2记载的16T1-6(导入基因纯合个体)的全DNA作为模板，进行PCR。PCR条件为反复进行35次包括在94℃下处理2分钟后，在94℃下进行30秒的热变性，在58℃下进行30秒的退火，在72℃下进行30秒的延伸反应的循环，最后，在72℃下处理2分钟。将PCR反应液进行琼脂凝胶电泳时，显示由越光DNA扩增了期待大小(210bp)的片断。另一方面，由16T1-6没能如预想地扩增该产物。
另外，用NosF2和No6R的引物组合，以越光和16T1-6的全DNA作为模板，在上述条件下进行PCR。其结果，由16T1-6扩增了期待大小(234bp)的片断。另一方面，由越光没能如预想地扩增该产物。
以上的结果显示了，在16T0-6中的导入基因插入位点是对应于第6染色体的AP004007位点。
(2)16T0-26中的导入位点的鉴定
(材料和方法)
用PstI完全消化实施例1使用的16T0-26的DNA，并按照上述(1)记载的方法扩增导入位点，并分析碱基序列。其中，PCR的缓冲液使用添加了TaKaRa LA Taq(TAKARA)的GC缓冲液(I)。
(结果和考察)
将第2次的PCR反应液进行琼脂凝胶电泳，回收约1700bp的片断。确定回收的片断的末端碱基序列，并对于基因库公开数据库进行BLAST检索(Altschul et al.，1990)。其结果，可知与日本晴的第10染色体的染色体组克隆(编号AC026758)的序列一致。
因此，对于AC026758的序列，在图9所示的位置设计了：
No26 F：
5’-ccccccccctctcctct-3’(序列号68)
以及
No26 R：
5’-tcccaccaaagggcattcctctcatc-3’(序列号69)
2个引物。使用这些引物，以越光和实施例2记载的16T1-26(导入基因纯合个体)的全DNA作为模板，进行PCR。PCR条件为反复进行35次包括在94℃下处理2分钟后，在94℃下进行30秒的热变性，在58℃下进行30秒的退火，在72℃下进行30秒的延伸反应的循环，最后，在72℃下处理2分钟。将PCR反应液进行琼脂凝胶电泳时，显示由越光DNA扩增了期待大小(246bp)的片断。另一方面，由16T1-26没能如预想地扩增该产物。
另外，用Nos F2和No26 R的引物组合，以越光和16T1-26的全DNA作为模板，在上述条件下进行PCR。其结果，由16T1-26扩增了期待大小(352bp)的片断。另一方面，由越光没能如预想地扩增该产物。
以上的结果显示了，在16T0-26中的导入基因插入位点是对应于第10染色体的AC026758位点。
(3)16T0-34中的导入位点的鉴定
(材料和方法)
用BamHI完全消化实施例1使用的16T0-34的DNA，并按照上述(1)记载的方法扩增导入位点，并分析碱基序列。
(结果和考察)
将第2次的PCR反应液进行琼脂凝胶电泳，回收约1700bp的片断。确定回收的片断的末端碱基序列，并对于基因库公开数据库进行BLAST检索(Altschul et al.，1990)。其结果，在2002年9月9日时，没有发现具有该序列的克隆。
(4)16T0-35中的导入位点的鉴定
(材料和方法)
用PstI完全消化实施例1使用的16T0-35的DNA，并按照上述(1)记载的方法扩增导入位点，并分析碱基序列。
(结果和考察)
将第2次的PCR反应液进行琼脂凝胶电泳，回收约500bp的片断。确定回收的片断的末端碱基序列，并对于基因库公开数据库进行BLAST检索(Altschul et al.，1990)。其结果，可知与日本晴的第7染色体的染色体组克隆(编号AP004009)的序列一致。
因此，对于AP004009的序列，在图9所示的位置设计了：
No35 F：
5’-ggctagggtttggggaaatgggcg-3’(序列号70)
以及
No35 R：
5’-cgtcatcatcttctcccaaaacagcc-3’(序列号71)
2个引物。使用这些引物，以越光和实施例2记载的16T1-35(导入基因纯合个体)的全DNA作为模板，进行PCR。PCR条件为反复进行35次包括在94℃下处理2分钟后，在94℃下进行30秒的热变性，在58℃下进行30秒的退火，在72℃下进行30秒的延伸反应的循环，最后，在72℃下处理2分钟。将PCR反应液进行琼脂凝胶电泳时，显示由越光DNA扩增了期待大小(235bp)的片断。另一方面，由16T1-35没能如预想地扩增该产物。
另外，用Nos F2和No35 R的引物组合，以越光和16T1-35的全DNA作为模板，在上述条件下进行PCR。其结果，由16T1-35扩增了期待大小(177bp)的片断。另一方面，由越光没能如预想地扩增该产物。
以上的结果显示了，在16T0-35中的导入基因插入位点是对应于第7染色体的AP004009位点。
实施例4通过Rf-1累积系的碘-碘化钾染色的花粉育性调查
(材料和方法)
提供下述的植物材料。
1)MS越光
2)越光
3)FR越光(通过连续回交在越光中导入Rf-1基因的系统)
4)MS越光×FR越光
5)16T1-6、16T1-26、16T1-34、16T1-35的自交下一代(16T2-6、16T2-26、16T2-34、16T2-35)
6)MS越光×16T1-6、MS越光×16T1-26、MS越光×16T1-34、MS越光×16T1-35
7)FR越光×16T1-6、FR越光×16T1-26、FR越光×16T1-34、FR越光×16T1-35
8)3位点Rf-1杂合子
9)4位点Rf-1杂合子
8)和9)的3位点Rf-1杂合子以及4位点Rf-1杂合子如下制作。为了制作3位点Rf-1杂合子，从(FR越光×16T1-6)×(FR越光×16T1-35)的交配得到的植物39个体提取DNA，并通过如下述的DNA标记推定各个体的Rf-1位点基因型、16T1-6的导入基因位点基因型(第6染色体)以及16T1-35的导入基因位点基因型(第7染色体)。对于Rf-1位点，按照Komori et al.，2002，从S12564 Tsp509I位点以及C1361 MwoI位点的基因型推定。对于16T1-6的插入基因位点，在进行使用了实施例3记载的Nos F2以及No6 R的PCR，扩增234bp的片断时，该位点的基因型看作是杂合的。同样地，在进行使用了实施例3记载的Nos F2以及No35 R的PCR，扩增177bp的片断时，16T1-35的导入基因位点的基因型看作是杂合的。标记鉴定的结果，推定用本交配得到的集团中的3个体对于Rf-1位点、16T1-6导入基因位点以及16T1-35的导入基因位点全部都是杂合的。
另外，为了制作4位点Rf-1杂合子，对于用(16T1-34×16T1-6)×(FR越光×16T1-35)的交配得到的植物62个体，推定Rf-1位点基因型、16T1-6导入基因位点基因型、16T1-35的导入基因位点基因型以及16T1-34的导入基因位点基因型。对于16T1-34的导入基因位点，使用实施例3记载的Nos F2以及
No34 R：
5’-cctttatacctccccacttcttatcc-3’(序列号72)
进行PCR。PCR条件为反复进行35次包括在94℃下处理2分钟后，在94℃下进行30秒的热变性，在58℃下进行30秒的退火，在72℃下进行30秒的伸长反应的循环，最后，在72℃下处理2分钟。在将PCR反应液进行琼脂凝胶电泳，扩增245bp的片断时，同位点的基因型看作是杂合的。标记鉴定的结果，推定用本交配得到的集团中的5个体对于Rf-1位点、16T1-6导入基因位点、16T1-35的导入基因位点以及16T1-34的导入基因位点全部都是杂合的。
从1)到9)的各品种和系的2个体，每个个体取样出穗后的4个未开花的颖花。从各颖花中取出药，在碘-碘化钾液体中轻轻粉碎后进行显微镜观察。将通过碘淀粉反应呈现深蓝色的花粉看作是结实花粉，除此以外的花粉看作是不育花粉。对于各颖花，调查了200花粉或200花粉以上。
(结果和考察)
算出每个颖花的花粉育性，对于各品种·系，将求出了8颖花的花粉育性的平均值以及标准偏差的结果示于表2。
[表2]
表2 通过碘-碘化钾染色的花粉育性调查结果
1)MS越光、2)越光、3)FR越光以及4)MS越光×FR越光的理论花粉育性分别为0％、100％、100％以及50％，实际上观察到与这些理论值接近的花粉育性。
5)的16T2-6、16T2-26、16T2-34、16T2-35显示与FR越光同等程度的花粉育性，另外，6)的MS越光×16T1-6、MS越光×16T1-26、MS越光×16T1-34以及MS越光×16T1-35显示与MS越光×FR越光同等程度的花粉育性。这些结果暗示了遗传工程学地导入的各Rf-1基因与内源Rf-1基因同样地发挥功能。
7)的FR越光×16T1-6和FR越光×16T1-35的花粉育性分别为74％和76％。FR越光具有的内源Rf-1基因位于第10染色体上，16T1-6以及16T1-35具有的导入Rf-1基因如实施例3所记载，分别位于第6和第7染色体上。因此，可以认为在上述F1中，同时具有内源Rf-1和导入Rf-1的花粉、只具有内源Rf-1的花粉、只具有导入Rf-1的花粉以及不具有任何一种Rf-1的花粉以1∶1∶1∶1的比例分离。由于这些F1的花粉育性大约为75％，可以推测具有1个或1个以上Rf-1的花粉具有育性。
FR越光×16T1-34的花粉育性为70％，接近于内源Rf-1以及Rf-1独立的场合的期望值75％。虽然没有鉴定16T1-34具有的导入Rf-1基因的位置，但从本结果显示为至少与第10染色体的内源Rf-1位点没有强的连锁关系的位置。
FR越光×16T1-26的花粉育性为92％。16T1-26所具有的Rf-1基因如实施例3所记载，位于第10染色体的AC026758的内部，AC026758对应于RFLP标记位点C797。另一方面，FR越光所具有的内源Rf-1基因与第10染色体的RFLP标记位点S12546紧密连锁(Komari et al.，2002)。根据RFLP连锁图(Harushima et al.，1998)，C797和S12564之间的图距为约20cM。两个标记间的重组值为约20％时，FR越光×16T1-26的理论花粉育性计算为约90％，观察到的花粉育性与该理论值接近。
8)的3位点Rf-1杂合子由于在第6、第7以及第10染色体中具有Rf-1，各Rf-1独立地遗传。因此，在这些个体中，具有3个、2个、1个和0个Rf-1的花粉期望以1∶3∶3∶1的比例分离。由于这些个体的花粉育性大约为87.5％，具有1个或1个以上Rf-1的花粉显示了具有育性，并且推测具有3个Rf-1的花粉也是正常发育的花粉。
另外，对于9)的4位点Rf-1杂合子，由于没有鉴定16T1-34的导入基因位点，各Rf-1是否独立地遗传是不明确的。可是，观察到了与假定各Rf-1独立地遗传、并且具有1个或1个以上Rf-1的花粉具有育性时的理论上的花粉育性93.75％极其接近的值。由此可以推测具有4个Rf-1基因的花粉也是正常发育的花粉。
实施例5累积Rf-1基因系的花粉发芽试验
(材料和方法)
提供下述的植物材料。
1)越光
2)MS越光×FR越光
3)FR越光×16T1-6、FR越光×16T1-35
从各品种和系的2个体，每个个体选择4个开花中的颖花，用镊子夹取药，直接置于花粉发芽培养基上。花粉发芽培养基按照已有的报道(Kariya，1989)使用包含1％ Agar、20％ Sucrose、20ppm H3BO3的琼脂培养基。经过20分钟后，进行显微镜观察，并将确认了花粉管伸长的花粉看作是育性花粉。对于各颖花，调查了20花粉或20花粉以上。
(结果和讨论)
算出每个颖花的发芽率，对于各品种·系，将求出8颖花的发芽率的平均值及标准偏差的结果示于表3中。
[表3]
表3 花粉发芽率调查的结果
越光和MS越光×FR越光的发芽率分别为93％和39％。FR越光×16T1-6和FR越光×16T1-35的发芽率分别为58％和66％，虽然不如越光的发芽率高，但比MS越光×FR越光的发芽率显著地高。
如果综合考虑通过碘-碘化钾染色的花粉育性调查的结果，多位点Rf-1杂合系与通常的杂交(单一位点Rf-1杂合)比较，积蓄淀粉的花粉的比例，即，正常发育的花粉的比例增加，其结果，可以认为实际发芽的花粉的比例也增加。
实施例6 2位点Rf-1纯合育性恢复系以及3位点Rf-1纯合育性恢复系的制作
2位点Rf-1纯合育性恢复系按照以下的方法制作。从FR越光×16T1-6的杂交F2的24个体提取DNA，推定各个体的Rf-1位点以及16T1-6的导入基因位点(第6染色体)中的基因型。对于Rf-1位点，按照Komori et al.，2002，由S12564 Tsp509I位点以及C1361 MwoI位点的基因型推定。对于16T1-6的导入基因位点，在进行使用了实施例3记载的No6 F和No6 R的PCR，210bp的片断不被扩增时，同位点的基因型看作是导入基因纯合。由标记鉴定的结果推测，调查的相当数量的1个体在Rf-1位点和16T1-6的导入基因位点的两位点是育性恢复基因纯合。
3位点Rf-1纯合恢复系按照以下的方法制作。如实施例4所记载，从(FR越光×16T1-6)×(FR越光×16T1-35)的交配得到的植物39个体提取DNA，并通过如下述的DNA标记推定各个体的Rf-1位点、16T1-6的导入基因位点(第6染色体)以及16T1-35的导入基因位点(第7染色体)。对于Rf-1位点，按照Komori et al.，2002，从S12564 Tsp509I位点以及C1361 MwoI位点的基因型推定。对于16T1-6的导入基因位点，在进行使用了实施例3记载的Nos F2以及No6 R的PCR，扩增234bp的片断时，同位点的基因型看作是杂合的。同样地，在进行使用了实施例3记载的Nos F2以及No35 R的PCR，扩增177bp的片断时，16T1-35的导入基因位点的基因型看作是杂合的。标记鉴定的结果，推测用本交配得到的集团中的1个体在Rf-1位点为Rf-1纯合、并且在16T1-6导入基因位点以及16T1-35的导入基因位点的两位点为杂合。
因此，从其个体的自交下一代(F2)24个体提取DNA来推定各个体的16T1-6的导入基因位点和16T1-35的导入基因位点的基因型。对于16T1-6的导入基因位点，如上述，在进行使用了实施例3记载的No6 F和No6 R的PCR，210bp的片断不被扩增时，同位点的基因型看作是导入基因纯合。对于16T1-35的导入基因位点，在进行使用了实施例3记载的No35 F和No35R的PCR，235bp的片断不被扩增时，同位点的基因型看作是导入基因纯合。标记鉴定的结果推测，调查的相当数量的2个体在16T1-6的导入基因位点和16T1-35的导入基因位点的两位点是育性恢复基因纯合。这些个体由于Rf-1位点是Rf-1纯合，故合计3位点是Rf-1纯合。
实施例7 耐冷性鉴定
(材料和方法)
提供越光、MS越光×FR越光的F1以及FR越光×16T1-35(记载于实施例4中)的F1。按照通常的方法培育到移植期后，对各品种和品系，将4个体移植到1/5000R的华格纳钵中(4个体、1钵)。移植后，在设定了光条件(24℃)12小时、暗条件(19℃)12小时的人工气象器中栽培。成熟后，从各个体取样10穗，对于各穗，求出种子育性(全部颖果中的结实颖果的比例)，并将10穗的种子育性的平均作为该个体的种子育性。
(结果和考察)
4个体的平均种子育性，越光为约95％，MS越光×FR越光的F1为约57％。与越光相比较，由于MS越光×FR越光的F1的种子育性低，可认为通过此次使用的低温条件，可以进行耐冷性的品种和系间比较。另外，FR越光×16T1-35的F1的4个体的平均种子育性为约76％，虽然不象越光那样高，但比MS越光×FR越光的F1高。进行种群比率的差异的鉴定时，MS越光×FR越光的F1(5808颖果中的3276颖果结实)和FR越光×16T1-35的F1(5900颖果中的4587颖果结实)之间的种子育性差为1％显著水平。本结果意味着，在多位点以对于Rf-1基因杂合的(heterozygous)的杂种与现有的杂种比较，即使在低温条件也维持高的种子育性。从以上的结果可认为，通过使用在多位点对于Rf-1基因纯合的育性恢复系，可以提高杂交品种的耐冷性。
机译： 改善杂交植物育性的方法，包括将育性恢复基因置于多个基因座中
机译： 提高将育性恢复基因插入多个基因座的杂交植物的育性的方法
机译： 提高杂交植物育性的方法，包括在多个基因座上定位育性恢复基因
