甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育恢复基因的图位克隆和功能研究

摘要

波里马细胞质雄性不育(pol CMS)是甘蓝型油菜杂种优势利用的主要途径之一，同时也是研究核质互作的良好载体。本研究通过图位克隆的方法分离了波里马细胞质雄性不育的育性恢复基因Rfp，并利用细胞学和分子生物学方法对其进行了相关研究，阐述了Pol CMS的败育机理及Rfp基因在甘蓝型油菜中的恢复功能。主要研究结果如下:
　　1.利用不育系6330A和恢复系Bing409构建的回交群体通过图位克隆的方法将波里马细胞质雄性不育恢复基因（Rfp）定位到甘蓝型油菜A9染色体上一段长约32kb的区间。对定位区间中的orf进行序列分析发现其中一个为PPR家族成员，将之作为候选基因构建载体。遗传转化证明该orf确实是波里马细胞质雄性不育恢复基因（Rfp）。
　　2.对该基因的全长(包括启动子区，CDS和3'UTR)在不育系1141A和恢复系Bing409中进行比较测序，比较测序结果表明Rfp与rfp启动子区和3'UTR区分别个有一个SNP，而在CDS上存在45个SNP，导致30个氨基酸的改变，其中12个氨基酸的极性发生变化。亚细胞定位的结果显示Rfp和rfp均定位于线粒体。这表明恢复基因与其等位基因功能的差异主要是由于CDS区的变异导致，但这些变异并未引起蛋白定位的改变。基于上述的测序结果，开发了针对Rfp的功能标记，可以高效地用于波里马细胞质雄性不育恢复材料的筛选和恢复系的回交选育。
　　3.半薄切片结果表明不育单株花药在发育至第5期不能形成四个正常的角隅，向后发育也不能形成药室或者形成1-2个形态异常的药室，而形成的药室中小孢子的发育异常，最终不能形成花粉或者产生干瘪的花粉。透射电镜结果表明不育单株在花药发育的第3期线粒体开始出现异常和崩解，可能引发孢原细胞的PCD，最终导致L2层细胞不能分化出正常的药室内壁，中层，绒毡层以及小孢子母细胞。
　　4.对Rfp基因进行RT-PCR和qPCR分析，结果表明Rfp油菜的根、茎、叶、花和幼蕾各个组织中广泛表达，幼蕾中表达量最高，GUS分析结果与之类似，说明恢复基因可能主要在花药发育早期起重要功能。在花药中GUS染色结果表明Rfp表达的主要部位在L2层细胞特化出的药室内壁，中层，绒毡层以及小孢子母细胞（小孢子）中，这与不育表型相对应。
　　5.为了探究Rfp可能的功能，以pol胞质（不育系）和nap胞质（保持系）线粒体组差异的orf作为探针进行Northern blot的检测。其中以orf224作为探针检测时发现在与不育系相比遗传转化复育系和恢复系中orf224-atp6转录本发生明显减少，而保持系中基本检测不到信号。这表明Rfp可能通过转录后调控的方式参与orf224转录本的加工从而恢复育性。
　　6.对Rfp进行预测发现其具有15个PPR结构域，可能与RNA识别相关，但它本身不具有RNA剪切或者其他加工的结构域，据此推测可能还存在其他未知蛋白参与该过程。通过酵母双杂，在甘蓝型油菜花蕾cDNA文库中共筛选到了4个可能与Rfp互作的基因，通过BiFC的检测证实这些互作在甘蓝型油菜的线粒体中真实存在。对这些互作的基因进行了干涉，它们的具体功能需进一步研究。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 文献综述

1．1 前言

1．2 植物细胞质雄性不育研究进展

1．2．1 植物细胞质雄性不育的遗传特征和形态学特征

1．2．2 植物细胞质雄性不育基因的克隆和功能分析

1．2．3 植物细胞质雄性不育的不育机制

1．3 植物细胞质雄性不育育性恢复研究进展

1．3．1 植物细胞质雄性不育育性恢复基因的遗传特征

1．3．2 植物细胞质雄性不育恢复基因的克隆和功能分析

1．3．3 植物细胞质雄性不育的恢复机制

1．4 植物PPR家族基因研究进展

1．4．1 植物中PPR基因家族的进化

1．4．2 PPR基因家族的功能

1．4．3 RNA的识别和结合机制

1．5 本研究的目的和意义

2 材料和方法

2．1 试验材料

2．2 花药表型观察

2．2．1 半薄切片

2．2．2 透射电镜

2．2．3 扫描电镜

2．3 图位克隆

2．3．1 分子标记的开发

2．3．2 油菜DNA的提取

2．3．3 标记分析

2．3．4 群体扫描与图谱构建

2．3．5 预测候选基因

2．3．6 候选基因的比较测序

2．4 载体的构建

2．4．1 互补测验载体构建

2．4．2 超表达载体构建

2．4．3 干涉载体构建

2．4．4 启动子分析载体构建

2．4．5 亚细胞定位载体构建

2．4．6 荧光双分子互补载体构建

2．4．7 酵母双杂交载体构建

2．5 遗传转化

2．5．1 拟南芥的遗传转化

2．5．2 甘蓝型油菜的遗传转化

2．6 RT-PCR与qPCR分析

2．7 GUS染色

2．8 亚细胞定位

2．9 序列分析与功能预测

2．10 Northern blot

2．11 酵母双杂交

2．12 荧光双分子互补(BiFC)

2．13 超表达与干涉

3 结果与分析

3．1 Pol CMS花药败育的细胞学观察

3．1．1 Pol CMS花药半薄切片分析

3．1．2 Pol CMS花药透射电镜分析

3．1．3 Pol CMS扫描电镜分析

3．2 Rfp基因的精细定位

3．2．1 与Rfp基因紧密连锁分子标记的开发和筛选

3．2．2 Rfp基因的图谱定位及定位区间的共线性分析

3．3 Rfp基因的克隆

3．3．1 候选基因的预测

3．3．2 候选基因的比较测序

3．3．3 候选基因遗传转化

3．3．4 共分离检测

3．4 Rfp基因的表达模式

3．4．1 RT-PCR分析

3．4．2 qPCR分析

3．4．3 GUS染色分析

3．5 Rfp基因的亚细胞定位

3．6 Rfp基因序列分析与功能初探

3．6．1 序列分析

3．6．2 Northern blot

3．7 Rfp功能复合体的探究

3．7．1 酵母双杂交筛选互作基因

3．7．2 筛选基因的亚细胞定位

3．7．3 荧光双分子互补(BiFC)验证互作关系

3．7．4 干涉验证复合体功能

4 讨论

4．1 甘蓝型油菜的图位克隆

4．1．1 定位群体的构建

4．1．2 比较基因组以及参考基因组序列的利用

4．1．3 二代测序技术的应用

4．2 细胞质雄性不育恢复基因研究在育种中的应用

4．2．1 分子标记的利用可以提高育种效率

4．2．2 恢复基因的克隆为人工创制恢复系奠定基础

4．3 波里马细胞质雄性不育败育败育的表型及机制

4．4 Rfp基因的功能

4．5 Rfp基因的进化

参考文献

致谢

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