小反刍兽疫病毒FY株分离、N基因表达及全基因组序列解析

摘要

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)主要发生在发展中国家，严重危害养羊业的发展，其跨境传播能力强，致死率最高可达100％。我国目前报道的小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）流行毒株主要集中于西藏和新疆等养羊业比较集中的地区，其它地区的流行毒株少有报道。本研究对2014年从浙江富阳分离的一株PPRV流行毒株（FY株）进行了分离和鉴定，同时对其全基因组进行了测序和分析，以期为我国PPRV分子流行病学研究提供新的参考资料，并丰富PPRV基因库，这将有助于分析病毒变异状况，研究PPRV在我国的遗传背景等信息，选择适合的疫苗以及研发新型疫苗。本论文内容包括以下3个方面。
　　1、PPRV FY株的分离和鉴定:将从浙江省富阳市采集的PPRV病料进行研磨，经离心、除菌后，分别接种于长满单层的Vero细胞、BHK细胞及CV细胞(CV)。培养96h后，收集细胞培养物，再在上述细胞中盲传3-5代。结果发现PPRV FY株在vero细胞和BHK细胞中均没有明显细胞病变出现，但是在CV细胞中出现典型细胞病变，主要表现为:细胞变圆、脱落、出现合胞体。待细胞出现80％左右病变时，收获细胞培养物，然后分别使用RT-PCR、Western Blot、间接免疫荧光及电镜负染等方法对病毒分离物进行鉴定。检测结果表明，从CV细胞培养物中能特异性地检测到PPRV的基因组，Western Blot、间接免疫荧光检测结果均证明用CV细胞分离到的病毒可与PPRV单抗F发生特异性反应。将收获的CV细胞培养物进行超速离心，纯化出病毒，然后用电子显微镜进行观察，可以看到具有囊膜的，直径在150-300nm之间的病毒颗粒，符合已报道的PPRV病毒颗粒形态学特征。上述研究结果证明，我们成功应用CV细胞分离到了PPRV，并将其命名为FY株。
　　2、PPRV FY株N基因的原核表达及多抗的制备:扩增PPRV FY株N基因序列，连接到pET-32a载体上测序分析，测序正确后转化到(E.coli) BL21(DE3)菌株中，IPTG诱导，表达重组N蛋白，并采用包涵体纯化的方法纯化重组蛋白，将纯化蛋白免疫实验兔，制备多克隆抗体，并使用Western Blot及间接免疫荧光等方法对得到的多抗进行鉴定，结果表明所制备多抗特异性良好并可用于PPRV的初步检测。
　　3、PPRV FY株的全基因组序列测定及分析:根据已经发表的PPRV参考毒株序列，设计了11对特异性扩增引物，然后用RT-PCR方法分段扩增出PPRV FY株的全基因组序列，应用DNAstar软件和MEGA软件对PPRV FY株及参考毒株的基因序列进行了比对和分析，并根据N基因核苷酸序列绘制了系统进化树。试验结果表明PPRV FY株基因组全长为15948nt，推测编码6种结构蛋白（N、P、L、M、F和H），2种非结构蛋白（C和V），PPRV各毒株转录起始序列和转录终止序列都高度保守。同源性比较分析结果显示，PPRV FY株与科特迪瓦来源毒株具有最低的同源性，然而与西藏来源毒株具有最高同源性，其基因间隔区N-P长度一致，相似度最高，而M-F相似度最低，通过比较PPRV FY株与参考毒株基因组末端调控序列，还可以看出在整个麻疹病毒属GP区和AGP区保守性较高，且存在不同程度的互补。氨基酸序列分析结果揭示PPRV FY株在保守区域出现21处氨基酸突变，这些突变对其所编码蛋白的结构和功能有何影响尚需要进一步研究。根据PPRV N基因序列，我们对PPRV FY株及参考毒株进行了系统进化分析。分析结果发现，PPRV FY株与其它亚洲源PPRV野毒株共同形成一个拓扑群，属于第Ⅳ谱系。
　　综上所述，本研究成功分离到了2014年流行于浙江省的PPRV流行毒株FY株，该毒株对细胞的适应性不强，仅能在表达其受体基因的细胞系中增殖。在此基础上，我们完成了对其全基因组序列的测定、N基因的原核表达及生物信息学分析，证明PPRV FY株属于基因Ⅳ型，并且与疫苗株的同源性较低，但与我国报道的其它野毒株具有较高同源性。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 小反刍兽疫及其病原研究进展

1．1 前言

1．2 小反刍兽疫概述

1．3 小反刍兽疫病原学

1．3．1 病毒的理化特性和生物学特性

1．3．2 病毒的基因组结构

1．3．3 编码的蛋白及功能

1．3．4 感染与增殖过程

1．4 流行与分布

1．5 预防免疫

第二章 小反刍兽疫病毒FY株的分离与鉴定

2．1 材料

2．1．1 病料来源

2．1．2 主要试剂和仪器

2．1．3 试验细胞及单抗

2．2 方法

2．2．2 细胞培养

2．2．3 病毒的分离培养

2．2．4 病毒的鉴定

2．3 结果

2．3．1 病毒分离结果

2．3．2 RT-PCR鉴定结果

2．3．3 间接免疫荧光鉴定

2．3．4 Western Blot鉴定

2．3．5 病毒形态观察

2．3．6 病毒滴度的测定

2．3．7 病毒一步生长曲线

2．4 讨论

第三章 小反刍兽疫病毒FY株N基因的原核表达及多抗的制备

3．1 材料

3．1．2 实验动物

3．2 方法

3．2．1 引物设计

3．2．2 PPRV N基因的扩增与纯化

3．2．3 重组表达载体的构建及鉴定

3．2．4 PPRV N基因的诱导表达及可溶性分析

3．2．5 包涵体蛋白的纯化

3．2．6 纯化蛋白的定量

3．2．7 多克隆抗体的制备

3．2．8 Western Blot检测多抗特异性

3．2．9 间接免疫荧光实验(IFA)

3．3 结果

3．3．1 目的基因的扩增及重组表达质粒的构建

3．3．2 重组N蛋白的表达及可溶性分析

3．3．3 表达产物的纯化与定量

3．3．4 间接免疫荧光试验(IFA)鉴定多抗效果

3．3．5 Western Blot鉴定多抗效果

3．4 讨论

第四章 小反刍兽疫病毒FY株全基因组序列测定及分析

4．1 材料

4．1．2 主要试剂和仪器

4．2 方法

4．2．1 引物设计合成

4．3．1 RT-PCR结果

4．3．2 PPRV FY株基因组长度与基因排布

4．3．3 PPRV FY株与参考毒株同源性比较

4．3．4 PPRV FY株与参考毒株基因间隔区序列比较

4．3．5 PPRV FY株与参考毒株末端调控序列及编码区氨基酸序列比较

4．3．6 保守区域氨基酸序列分析

4．3．7 PPRV FY株系统进化分析

4．4 讨论

结论

参考文献

附录

英文缩略表

致谢

作者简介