一株致严重呼吸道疾病新的树鼩腺病毒分离鉴定及全基因组序列解析

摘要

树鼩腺病毒(Tree Shrew Adenovirus，TAV)是一种线性双链DNA病毒，属于腺病毒科，哺乳动物腺病毒属。腺病毒感染会引起急性上呼吸道感染、急性结膜炎、急性出血性膀胱炎、腹泻等疾病。树鼩（Tupaia belangeri）作为与灵长类动物亲缘关系最近的新型模式动物，与人类及灵长类动物较高的遗传同源性，在人类疾病模型尤其是感染性疾病模型和临床前药物开发研究中发挥着不可或缺的作用，已逐步成为生物医学研究的热点。前期开展的相关研究表明，野生来源树鼩中腺病毒核酸检测率较高，并有疑似病例发生，因此被列为该动物微生物质量控制的检测指标之一，但迄今国内还未见成功分离的报道。本研究从树鼩偶发呼吸道疾病及腹泻临床症状推测可能是由某种病毒感染引起，采用病毒分离方法首次从树鼩这一物种分离鉴定到树鼩腺病毒。为揭示这株TAV在腺病毒家族中所处的进化地位、遗传信息以及对树鼩健康是否存在潜在威胁，本研究对所获得的TAV进行了全基因组序列解析。 首先，对来自患有严重呼吸道疾病的树鼩气管及肺组织样品进行病理学检测及样品处理，通过树鼩原代肾细胞(Tree Shrew kidney cells，TKC)培养，产生典型的细胞病变。肺组织病理学检测结果为间质性肺炎。经病毒DNA特异性检测、免疫荧光检测和浓缩病毒的负染电镜观察，鉴定为腺病毒，命名为TAV-KM(Tree Shrew Adenovirus Kunming strain)。 其次，为了建立高效、特异的分子检测手段，根据NCBI Tree Shrew Adenovirus1全基因组3'端保守序列设计合成特异性引物，用含目的基因片段的重组质粒作为标准品进行标准曲线绘制，成功建立树鼩腺病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。建立的TAV实时荧光定量PCR检测方法特异性强，与树鼩源其他病毒无交叉反应，方法的最低检测限度为3.7copies/μL，灵敏性强。相关检测系数R2为0.998，扩增效率为95.7％，扩增结果具有良好的线性关系，且重复性检测效果好。 最后，通过TKC对TAV-KM进行大量扩增富集，用病毒纯化试剂盒进行纯化并浓缩，经二代测序获得TAV-KM的完整全基因组序列，随后用一代测序对主要编码蛋白进行验证和完善。为了进一步表明TAV-KM基因组的分子特征并确定其与早期德国分离树鼩腺病毒分离株(Tree shrew adenovirus1)的亲缘关系，比较了TAV-KM分离株与Tree shrew adenovirus1的核苷酸序列和氨基酸序列。 结果：显示：TAV-KM属于腺病毒科的哺乳动物腺病毒属，其进化分类地位处于独立的分支，并且TAV-KM与Tree shrew adenovirus1之间的遗传关系非常密切;TAV-KM基因组的长度为33487bp，比Tree shrew adenovirus1的基因组短14个碱基;TAV-KM基因组的G+C含量为50.07％，近似于Tree shrew adenovirus1(49.96％);TAV-KM基因组中有一个161bp的末端反向重复序列;以至少40个密码子长度分析得到110个开放阅读框(ORF)，其中32个是病毒的编码基因。同时对两株树鼩源腺病毒纤毛蛋白核酸及氨基酸序列进行比对，发现TAV-KM和Tree shrew adenovirus1之间的纤毛蛋白有9个氨基酸残基的差异。表明虽然有几十年的时间和地理隔离，但树鼩源腺病毒基因组序列具有较高的保守性。在氨基酸残基中存在2个同义突变，7个非同义突变，该突变可能导致TAV-KM易感性增强。 本论文的研究结果丰富了动物病毒数据库，为将来开展树鼩腺病毒感染模型建立提供了实验材料，为致病机理等相关研究奠定了基础。同时，腺病毒纤毛蛋白基因的突变而使其易感性增强，这些问题将在今后的工作中进一步阐明。

目录

摘要

前言

第一章树鼩病毒的分离鉴定

1．材料与方法

1．1实验材料

1．2实验试剂

1．3实验仪器

1．4实验方法

2．实验结果

2．2树鼩原代肾细胞TKC和CK18的鉴定

2．3 TKC感染肺组织样品的细胞病变

2．4 TKC感染含病毒样品的细胞超薄切片

2．5含病毒样品感染树鼩原代肾细胞免疫荧光检测

2．6 TAV普通PCR检测结果

3．讨论

第二章树鼩腺病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

1材料与方法

1．1实验材料

1．2实验方法

2结果

2．1目的片段的鉴定

2．2 TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线

2．3 TaqMan实时荧光定量PCR灵敏性

2．4 TaqMan实时荧光定量PCR重复性

2．5 TaqMan实时荧光定量PCR特异性

2．6 TaqMan实时荧光定量PCR初步应用

3讨论

第三章树鼩腺病毒全基因组解析

1材料与方法

1．1实验材料

1．2方法

2结果

2．1两株树鼩源腺病毒编码基因核苷酸及氨基酸序列比对结果

2．2系统进化树分析结果

2．3两株树鼩源腺病毒fiber基因氨基酸序列比对结果

3讨论

小结

参考文献

附录

致谢

研究生简历

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