基于RNA-seq测序技术糜子转录组分析以及糜子叶绿体基因组密码子使用模式分析

摘要

糜子（Panicum miliaceum L.），也称为黍、稷，是最古老的和首批被驯化作物之一，主要分布在亚洲和欧洲的半干旱地区。作为短日照C4作物，糜子具有很多优异农艺性状，比如高产，生长季比较短，需水量低，适合在各种土壤上生长，尤其是在贫瘠的沙壤土上，因此能够很好地适应比较极端环境。RNA-seq主要是基于NGS(Next generationsequencing)技术，可以高质量、高数量地普查所有转录元件（如转录组），包括mRNAs，小RNAs(small RNAs)和其他非编码RNAs(non-coding RNAs)。其转录组数据普查结果为不同生理状态下的器官、组织或者是细胞基因表达模式和调节原件等情况及时作出描述，这对进一步了解生物发展和病害发生过程十分重要。密码子使用偏好性(CUB)是由于同义密码子在机体内外的使用频率存在差异，其是生物体重要的进化特征，对研究物种进化、基因功能及其外源基因表达具有重要意义。
　　本研究将提取的Yumi2和Yumi3 RNA样品进行RNA-seq测序，对数据进行过滤、分析，对部分候选差异表达基因还进行RT-PCR验证。与此同时，还利用Mobyle等生物信息学软件对糜子叶绿体基因组密码子使用偏好性进行分析。得到分子结果如下:
　　1.利用Illumina测序平台对糜子4种组织的混合样品进行测序研究，得到113，643个contigs，组装总长度164，535，293 bp。经序列拼接共鉴定得到65，470条长于1 kb的unigenes。
　　2.将组装的unigene和NCBI中的NR数据库，Swiss-Prot数据库，COG数据库，KEGG数据库中蛋白序列进行blastx相似性比对分析发现共有60，352条unigene已经被注释。同时发现糜子unigenes和其他单子叶植物都具有同源性，包括高粱、水稻、二穗短柄草、乌拉尔图小麦、柳枝稷。
　　3.对糜子Unigene功能进行GO、KOG、KEGG代谢通路分析发现，总共62，543unigene序列注释到了3个主要的GO分类中;比对到KOG数据库基因上的33，671unigenes分类成25个不同的功能群;共有15，514 unigenes主要分到了202个KEGG代谢通路上。
　　4.在糜子中113，643 unigenes的27，055条序列中总共鉴定发现35，216 SSR位点。其中，2，536序列包括超过一个SSR。重复4次的SSRs是占比最高的重复类型，(49.99％)，接下来是重复5次、10次、6次、超过20次的SSRs，分别约14.45％、13.38％、8.79％、0.05％。在这么多不同类型的SSRs中，三核苷酸是最为丰富的重复单元，在所有的SSRs占比约为66.72％，其中CCG/CGG是最为丰富的结构单元。并且多数SSRs的长度是12bp(51.39％)。
　　5.共鉴定发现292个差异表达基因，被归入88条GO分类，12KEGG代谢通路中，并通过qRT-PCR验证了4个差异表达基因，分别是unigene34608，unigene35973 andunigene41558、Unigene33484。
　　6.从糜子叶绿体基因组中筛选出53条蛋白编码序列，通过codonW软件等分析表明，在糜子叶绿体基因组中，密码子GC3的含量为30.67％，所占比例最低;有效密码子数(ENC)表明多数密码子偏性比较弱;相对同义密码子使用度(RSCU)分析密码子多以A、U结尾，说明这些是糜子叶绿体基因组偏爱的密码子;中性分析、ENC-plot、对应性分析等结果说明糜子密码子偏好性是由于自然选择、变异压力及其他因素共同作用而形成。同时鉴定得到9个糜子叶绿体最优密码子。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 糜子概述

1．1．1 糜子栽培历史及其分布

1．1．2 糜子糯性以及丰富营养含量

1．1．3 糜子遗传多样性研究

1．1．4 糜子抗逆性研究进展

1．2 转录组研究进展

1．2．1 研究转录组基因方法

1．2．2 RNA-seq基本原理及其优势

1．2．4 RNA-Seq主要用途

1．2．6 RNA-Seq面临的挑战与展望

1．2．7 研究意义和目的

1．3 叶绿体基因组密码子使用偏好型研究

1．3．1 密码子偏好性概述

1．3．2 密码子偏好性理论基础

1．3．3 研究密码子偏好性的参数

1．3．4 研究意义

第二章 基于RNA-seq测序的糜子转录组学研究

2．1 实验材料和方法

2．1．1 实验材料准备

2．2．1 组织样品总RNA提取

2．2．3 文库构建及Illumina测序

2．2．4 序列数据分析及从头组装

2．2．5 功能注释

2．2．6 SSRs和SNPs标记筛选

2．2．7 差异表达基因注释及分析

2．2．8 qRT-PCR分析

2．2 结果

2．2．1 转录组数据测序和组装

2．2．2 糜子转录组注释和功能特征

2．2．3 SSRs和SNPs位点鉴定

2．2．4 差异表达基因鉴定与发现(DEGs)

2．2．5 差异表达基因qRT-PCR验证

2．3 讨论

第三章 糜子叶绿体基因组密码子使用偏好性分析

3．1 实验材料和方法

3．1．1 编码序列的获得

3．1．2 密码子使用偏好性参数

3．1．3 统计分析工具

3．2 结果

3．2．1 糜子叶绿体基因核苷酸含量分布

3．2．2 糜子叶绿体基因组相对同义密码子使用度分析

3．2．3 基于ENC值密码子偏好性分析

3．2．4 PR2绘图分析

3．2．5 对应性分析

3．2．6 最优密码子

3．3 讨论

第四章 结论与展望

参考文献

附录

致谢

作者简介