猪圆环病毒2型重组腺病毒载体疫苗的构建及其免疫原性研究

摘要

猪圆环病毒相关性疾病（PCVAD）是由猪圆环病毒2型(PCV2)引起的猪传染性疾病。接种疫苗是防控PCVAD最有效的手段，重组腺病毒载体疫苗已经有相关报道，但是由于腺病毒自身蛋白可以诱导宿主产生强烈的免疫应答反应，从而限制了这种疫苗在临床实践中的应用，如何降低自身免疫应答反应成为重组腺病毒载体疫苗规模化应用必须解决的关键科学问题。本研究构建了4类PCV2重组腺病毒载体疫苗，一是利用人巨细胞病毒第一内含子(Intron A)和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，构建Intron A和/或WPRE优化的PCV2重组腺病毒载体疫苗;二是通过共表达猪肿瘤坏死因子相关激活蛋白(tumor necrosis factor related activation protein，TRAP/CD40L)和粒细胞-巨细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GMCSF），构建CD40L和/或GMCSF优化的PCV2重组腺病毒载体疫苗;三是分别在CD40L、Cap和GMCSF的N端添加分泌型信号肽，构建分泌型重组腺病毒载体疫苗;四是分别在CD40L和GMCSF的N端添加分泌型信号肽，Cap N端添加跨膜型信号肽，构建跨膜型重组腺病毒载体疫苗。4类重组腺病毒载体疫苗均进行动物试验评价免疫效果，期望构建的这4类PCV2重组腺病毒载体疫苗能够提高PCV2Cap的表达效率和表达方式，从而降低腺病毒疫苗免疫剂量，减弱腺病毒载体自身的免疫原性，增强疫苗免疫效果，为PCV2重组腺病毒载体疫苗的规模化应用奠定基础。研究取得以下结果。
　　1.将Intron A和WPRE克隆到PCV2重组腺病毒，构建PCV2Cap、Intron A和WPRE相关重组腺病毒疫苗，分别命名为Ad-C、Ad-A-C、Ad-C-W和Ad-A-C-W。western blotting结果表明，在Ad-C、Ad-A-C、Ad-C-W和Ad-A-C-W感染细胞的蛋白样品中均可检测到Cap表达，并且Ad-A-C-W感染细胞的Cap表达量高于其他组。IFA结果表明，Ad-C、Ad-A-C、Ad-C-W和Ad-A-C-W感染的细胞均能检测到荧光，并且Ad-A-C-W感染细胞的荧光信号强于其他组。使用上述构建的重组腺病毒免疫小鼠2次，间隔14d。结果表明，一免后14d开始检测到特异性抗体和中和抗体。一免后35d至一免后56d，Ad-A-C-W免疫组特异性抗体水平和中和抗体水平显著高于其他组(p＜0.05)，Ad-A-C免疫组和Ad-C-W免疫组特异性抗体水平和中和抗体水平差异不显著，但均显著高于Ad-C免疫组(p＜0.05)。一免后28d至一免后56d，Ad-A-C-W免疫组淋巴细胞增殖水平、IFN-γ和IL-4分泌水平显著高于其他组(p＜0.05)，Ad-A-C免疫组和Ad-C-W免疫组差异不显著，但均显著高于Ad-C免疫组(p＜0.05)。
　　2.将CD40L和GMCSF克隆到PCV2重组腺病毒，构建PCV2Cap、CD40L和GMCSF相关重组腺病毒疫苗，分别命名为Ad-CD40L-Cap、Ad-Cap-GMCSF和Ad-CD40L-Cap-GMCSF。western blotting和IFA结果显示，重组腺病毒Ad-CD40L-Cap、Ad-Cap-GMCSF和Ad-CD40L-Cap-GMCSF均可以检测到相应蛋白表达。使用上述构建的重组腺病毒免疫小鼠2次，间隔14d。结果表明，一免后14d开始检测到特异性抗体和中和抗体。一免后21d至一免后56d，Ad-CD40L-Cap-GMCSF免疫组特异性抗体水平和中和抗体水平显著高于其他组(p＜0.05)，Ad-CD40L-Cap免疫组和Ad-Cap-GMCSF免疫组特异性抗体水平和中和抗体水平差异不显著，但均显著高于Ad-Cap免疫组(p＜0.05)。一免后28d至一免后56d，Ad-CD40L-Cap-GMCSF免疫组淋巴细胞增殖水平、IFN-γ和IL-4分泌水平显著高于其他组(p＜0.05)，Ad-CD40L-Cap免疫组和Ad-Cap-GMCSF免疫组差异不显著，但均显著高于Ad-Cap免疫组(p＜0.05)。
　　3.将重组腺病毒Ad-Cap、Ad-A-C-W和Ad-CD40L-Cap-GMCSF免疫猪，进行免疫保护试验，一免后14d加强免疫，一免后28d攻毒。结果显示，一免后21d至一免后77d，Ad-A-C-W免疫组和Ad-CD40L-Cap-GMCSF免疫组特异性抗体水平和中和抗体水平显著高于Ad-Cap免疫组(p＜0.05)。一免后28d，Ad-A-C-W免疫组淋巴细胞增殖水平和IFN-γ和IL-13水平显著高于Ad-Cap免疫组(p＜0.05)，但是显著低于Ad-CD40L-Cap-GMCSF免疫组(p＜0.05)。一免后35d至一免后91d，Ad-A-C-W免疫组和Ad-CD40L-Cap-GMCSF免疫组病毒载量均显著低于Ad-Cap免疫组(p＜0.05)。一免后91d试验结束后对各试验组猪进行了尸体剖检和组织病理学检查。Ad-Cap免疫组、Ad-A-C-W免疫组和Ad-CD40L-Cap-GMCSF免疫组均未见明显的解剖病理变化，镜检也未见明显的组织学病变。
　　4.首先构建重组腺病毒Ad-A-CD40L-Cap-GMCSF-W，然后分别在CD40L、Cap和GMCSF N端添加分泌信号肽，构建重组腺病毒Ad-A-spCap-W和Ad-A-spCD40L-spCap-spGMCSF-W，分别在CD40L和GMCSF N端添加分泌型信号肽，Cap N端添加跨膜型信号肽，构建重组腺病毒Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMC SF-W。western blotting结果表明，Ad-A-spCap-W和Ad-A-spCD40L-spCap-spGMCSF-W感染细胞上清中可检测到Cap表达，Ad-A-CD40L-Cap-GMCSF-W和Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W感染细胞裂解蛋白中可检测到Cap表达，Ad-A-spCD40L-spCap-spGMCSF-W和Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W感染细胞上清可检测到CD40L和GMCSF表达。激光共聚焦显微镜观察Ad-A-CD40L-Cap-GMC SF-W表达的Cap主要定位于PK15细胞质，Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W表达的Cap主要定位于PK15细胞膜。
　　5.将45头猪随机分为9组，每组5头，分别接种重组腺病毒Ad-Cap（组1）、Ad-A-spCap-W(组2)、Ad-A-CD40L-Cap-GMC SF-W(组3)、Ad-A-spCD40L-spCap-spGMCSF-W(组4)、Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W(组5)、商品化疫苗（组6）和空载体腺病毒Ad-wild（组7），第8组为非免疫攻毒组（组8），第9组为空白对照组（组9），评价疫苗的保护效果。一免后14d加强免疫，一免后28d攻毒。结果显示，一免后28d至一免后49d，组2特异性抗体水平显著低于组6(p＜0.05)，其余时间点与组6差异不显著。一免后35d至一免后63d，组3特异性抗体水平显著高于组6(p＜0.05)。一免后14d至一免后70d，组4和组5特异性抗体水平显著高于组6(p＜0.05)。western blotting结果表明，一免后14d，组2、组3、组4和组5猪血清就可以与Cap特异性结合。一免后14d至一免后70d，组2中和抗体水平与组6差异不显著。一免后35d至一免后63d，组3中和抗体水平显著高于组6(p＜0.05)。一免后21d至一免后70d，组4和组5中和抗体水平显著高于组6(p＜0.05)。一免后28d，组2和组3淋巴细胞增殖水平和IFN-γ和IL-13水平与组6差异不显著，组4和组5淋巴细胞增殖水平和IFN-γ和IL-13水平显著高于组6(p＜0.05)。一免后35d至一免后70d，组2病毒载量和组6差异不显著。一免后49d至一免后70d，组3病毒载量显著低于组6(p＜0.05)。一免后42d至一免后70d，组4和组5病毒载量均显著低于组6(p＜0.05)。一免后70d，对各组猪进行尸体剖检和组织病理学检查，组2、组3、组4和组5猪均未见明显病理变化。
　　本研究通过对腺病毒载体进行优化，构建了4类PCV2重组腺病毒疫苗，第一类是Intron A和/或WPRE优化的PCV2重组腺病毒疫苗;第二类是CD40L和/或GMCSF优化的PCV2重组腺病毒疫苗;第三类是分别在CD40L、Cap和GMCSF N端添加分泌型信号肽的重组腺病毒疫苗;第四类是分别在CD40L和GMCSF N端添加分泌型信号肽，CapN端添加跨膜型信号肽的重组腺病毒疫苗。动物试验结果表明，新构建的4类疫苗均能诱导机体产生良好的体液和细胞免疫应答。其中，第一类疫苗中的Ad-A-C-W和第二类疫苗中的Ad-CD40L-Cap-GMCSF动物免疫效果优于单一Intron A、WPRE、CD40L和GMCSF的PCV2重组腺病毒疫苗，并且前者优于后者，但是它们的免疫效果与商品化疫苗仍有差距。第三类疫苗中Ad-A-spCD40L-spCap-spGMCSF-W和第四类疫苗中Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W对猪的免疫保护效果最好，并且优于商品化疫苗。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 猪圆环病毒2型疫苗与腺病毒载体疫苗研究进展

1．1 猪圆环病毒2型疫苗研究进展

1．1．1 猪圆环病毒

1．1．2 猪圆环病毒2型疫苗

1．2 腺病毒载体疫苗研究进展

1．2．1 腺病毒概述

1．2．2 腺病毒载体疫苗

1．3 本研究的目的意义

第二章 PCV2 Cap、Intron A和WPRE重组腺病毒的构建及小鼠免疫试验

2．1 材料与方法

2．1．1 载体、细胞和生化试剂

2．1．2 仪器设备

2．1．3 目的基因的克隆及测序

2．1．4 重组腺病毒穿梭载体的构建

2．1．5 重组腺病毒的包装

2．1．6 重组腺病毒的扩增、纯化及病毒滴度测定

2．1．7 重组腺病毒的鉴定

2．1．8 小鼠免疫试验

2．2 结果

2．2．1 重组腺病毒穿梭载体的构建

2．2．2 重组腺病毒质粒pAd-C、pAd-A-C、pad-C-W和pAd-A-C-W的鉴定

2．2．3 重组腺病毒包装及病毒滴度

2．2．4 重组腺病毒目的蛋白鉴定

2．2．5 PCV2 Cap特异性抗体水平

2．2．6 中和抗体水平

2．2．7 淋巴细胞增殖水平

2．2．8 细胞因子水平

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 PCV2 Cap、CD40L和GMCSF重组腺病毒的构建及小鼠免疫试验

3．1 材料与方法

3．1．1 载体、细胞和生化试剂

3．1．2 仪器设备

3．1．3 目的基因的克隆及测序

3．1．4 重组腺病毒穿梭载体的构建

3．1．5 重组腺病毒的包装

3．1．6 重组腺病毒的扩增、纯化及病毒滴度测定

3．1．7 重组腺病毒的鉴定

3．1．8 小鼠免疫试验

3．2 结果

3．2．1 重组腺病毒穿梭载体的构建

3．2．2 重组腺病毒质粒pAd-CD40L-Cap、pad-Cap-GMCSF和pAd-CD40L-Cap-GMCSF的鉴定

3．2．3 重组腺病毒包装及病毒滴度

3．2．4 重组腺病毒目的蛋白鉴定

3．2．5 PCV2 Cap特异性抗体水平

3．2．6 中和抗体水平

3．2．7 淋巴细胞增殖水平

3．2．8 细胞因子水平

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 重组腺病毒Ad-A-C-W和Ad-CD40L-Cap-GMCSF猪免疫保护试验

4．1 材料与方法

4．1．1 主要试剂

4．1．2 仪器设备

4．1．3 实验动物

4．1．4 猪免疫保护试验

4．1．5 统计学分析

4．2 结果

4．2．1 体温变化

4．2．2 PCV2 Cap特异性抗体水平

4．2．3 中和抗体水平

4．2．4 淋巴细胞增殖水平

4．2．5 细胞因子水平

4．2．6 病毒血症水平

4．2．7 组织病理学变化

4．3 讨论

4．4 小结

第五章 分泌型和跨膜型PCV2重组腺病毒的构建及鉴定

5．1 材料与方法

5．1．1 载体、细胞和生化试剂

5．1．2 仪器设备

5．1．3 目的基因的克隆及测序

5．1．4 重组腺病毒穿梭载体的构建

5．1．5 重组腺病毒的包装

5．1．6 重组腺病毒的扩增、纯化及病毒滴度测定

5．1．7 重组腺病毒的鉴定

5．2 结果

5．2．1 重组腺病毒穿梭载体的构建

5．2．2 重组腺病毒质粒pAd-A-spCap-W、pAd-A-CD40L-Cap-GMCSF-W、pAd-A-spCD40L-spCap-spGMCSF-W和pAd-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W的鉴定

5．2．3 重组腺病毒包装及病毒滴度

5．2．4 重组腺病毒目的蛋白鉴定

5．3 讨论

5．4 小结

第六章 分泌型和跨膜型PCV2重组腺病毒猪免疫保护试验

6．1 材料与方法

6．1．1 主要试剂

6．1．2 仪器设备

6．1．3 实验动物

6．1．4 猪免疫保护试验

6．1．5 统计学分析

6．2 结果

6．2．1 体温变化

6．2．2 PCV2 Cap特异性抗体水平

6．2．3 western blotting检测血清抗体特异性

6．2．4 中和抗体水平

6．2．5 淋巴细胞增殖水平

6．2．6 细胞因子水平

6．2．7 病毒血症

6．2．8 组织病理学变化

6．3 讨论

6．4 小结

结论

本文的创新点

参考文献

英文缩略词及中英文对照

致谢

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