东方粘虫中肠胰蛋白酶基因上游启动子核心序列的克隆及功能验证

摘要

随着人们对食品安全以及绿色农业的持续深入的关注，对安全使用农药问题的认识也越来越深刻，因此，利用天然产物研究开发新型农药成了近年的热点之一。前期研究发现，杠柳新苷类化合物对东方粘虫具有一定的杀虫活性，并且可以上调昆虫体内胰蛋白酶的表达，使其发生过分表达分泌的现象，超出虫体自身的生命代谢水平，从而可能使其自身的器官和组织被该类酶水解破坏，最终导致昆虫死亡。但是，目前的研究尚未明确该类化合物如何产生这种效应，对其杀虫机理也未有明确的研究。
　　1.东方粘虫中肠胰蛋白酶基因启动子的缺失克隆
　　本研究利用生物信息学方法预测粘虫中肠胰蛋白酶基因启动子上游的序列中潜在的转录因子及其结合位点，根据初步预测的结果，设计出7段缺失引物，对靶标启动子进行分段PCR扩增，并将得到质粒重组到荧光素酶报告基因载体，共同转染至昆虫Sf21细胞系中，瞬时表达检测相对荧光活性，从而比较出各段启动子活性。试验结果表明靶标基因启动子区在-1003/-788和-274/-188间可能包含某些对胰蛋白酶基因转录调控起关键作用的转录因子结合位点，并且在-1003/-788之间可能存在转录激活因子，在-274/-188之间可能存在转录抑制因子。
　　2.东方粘虫中肠胰蛋白酶基因启动子的突变克隆
　　采用生物信息学预测方法，结合缺失片段启动子活性强弱，参考各个转录因子的结构与功能，预测出符合先前实验结果的可能存在的6个可能潜在的转录因子Zeste、Ubx、Myod、Cf2、SMAD、STAT的结合位点，并将其可能的结合位点序列突变，设计出6对突变引物，利用PCR技术对启动子序列进行突变克隆，构建包含有突变启动子片段质粒的表达载体，转染至Sf21细胞，瞬时表达后比较其各段启动子活性，发现突变Myod和Cf2的结合位点序列后，启动子活性与空白对照组有差异，从而推测这两个转录因子可能存在于粘虫体内，并对于粘虫中肠胰蛋白酶基因的转录调控有重要作用。
　　3.杠柳化合物对靶标基因启动子的影响
　　本试验为了探究杠柳新苷类化合物是否可以直接作用于靶标启动子，将供试药物利用DMSO溶解配制成不同浓度梯度的药剂，在由启动子全长构建的荧光素表达载体转染的Sf21细胞中直接用不同浓度的药剂孵育5h，待表达完成后与空白对照组比较启动子活性。结果表明，粘虫中肠胰蛋白酶基因启动子在杠柳新苷T低浓度处理下活性均有所降低，且随着杠柳新苷T处理浓度的升高，启动子活性降低，表明杠柳新苷T对胰蛋白酶基因启动子活性有影响。
　　本研究通过对粘虫中肠的胰蛋白酶基因进行了分析与预测，与空白对照的启动子活性比较，初步找到了靶标启动子基因中可能存在的转录因子结合位点，并利用杠柳新苷类化合物作用靶标启动子，结果表明，该类化合物对靶标启动子有一定影响，为杀虫剂作用于昆虫基因转录及表达水平的作用机制的研究奠定了理论基础。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 前言

1．2 启动子和转录因子

1．2．1 启动子概述

1．2．2 转录因子概述

1．2．3 转录因子的研究方法

1．3．1 真核生物的转录调控

1．3．2 活性化合物与转录因子

1．4 本研究的目的与意义

第二章 粘虫中肠胰蛋白酶基因启动子的缺失克隆及活性分析

2．1．1 试验材料

2．1．2 主要仪器

2．1．3 生物信息学软件

2．1．4 粘虫中肠胰蛋白酶基因启动子的缺失克隆

2．1．5 昆虫细胞培养

2．1．6 靶标启动子荧光素酶报告基因载体构建

2．1．7 细胞转染

2．1．8 荧光素酶活性测定

2．1．9 数据分析

2．2 结果与分析

2．2．1 生物信息学分析缺失片段启动子序列

2．2．2 粘虫中肠胰蛋白酶基因启动子的缺失克隆

2．2．3 细胞转染

2．2．4 缺失片段启动子活性分析

2．3 小结与讨论

第三章 粘虫中肠胰蛋白酶基因启动子的突变克隆及活性分析

3．1．1 试验材料

3．1．2 主要仪器

3．1．3 生物信息学软件

3．1．4 粘虫中肠胰蛋白酶基因启动子的突变克隆

3．1．5 昆虫细胞培养

3．1．6 靶标启动子荧光素酶报告基因载体构建

3．1．7 细胞转染

3．1．8 荧光素酶活性测定

3．1．9 数据分析

3．2．1 生物信息学分析突变片段启动子序列

3．2．2 粘虫中肠胰蛋白酶基因启动子的突变克隆

3．2．3 细胞转染

3．2．4 突变片段启动子活性分析

3．3 小结与讨论

第四章 杠柳新苷类化合物对粘虫中肠胰蛋白酶启动子活性影响

4．1 材料与方法

4．1．1 试验药剂与试剂

4．1．2 供试昆虫细胞

4．1．3 药剂配制方法

4．1．4 检测杠柳新苷类化合物对靶标启动子基因活性影响

4．2 结果与分析

4．3 小结与讨论

第五章 结论与讨论

参考文献

附录

致谢

作者简介