转基因天山雪莲类黄酮成分及抗肿瘤活性分析

摘要

天山雪莲是生长在我国高海拔地区的传统名贵的药用植物，富含黄酮类化合物。食管癌是常见的恶性肿瘤之一，很难治愈，严重影响着人们的生活质量。而有研究报道从很多植物中获得的花青苷对食管癌都具有较强的抗性。因此，本研究以转入花青苷合成调控基因（PAP1和LC）后呈现红色的天山雪莲愈伤组织为材料，从化学成分、药理活性和分子生物学三个方面系统的研究转基因和非转基因两种天山雪莲愈伤组织醇提物对人食管癌细胞 CaEs-17 的抗肿瘤活性，为高抗肿瘤活性天山雪莲育种提供理论支持，为天山雪莲的抗肿瘤功效得以充分利用提供技术支持。所得主要研究结果如下： （1）对两种天山雪莲愈伤组织的总黄酮含量进行检测，结果显示转基因天山雪莲愈伤组织的总黄酮含量（8257.88±759.20）mg?kg-1 DW是非转基因愈伤组织（3039.70 ±223.48）mg?kg-1 DW的2.72倍。 （2）对两种天山雪莲愈伤组织中单体酚的种类和含量进行分析，结果显示两种天山雪莲愈伤组织中单体酚的种类几乎相同，但是转基因天山雪莲愈伤组织中的单体酚含量较高，且在转基因愈伤组织中检测到了使其呈现红色的矢车菊素半乳糖苷（Cyanidin-galactoside），而非转基因愈伤组织中未检测到。 （3）采用CCK-8法和细胞形态学观察检测两种天山雪莲愈伤组织醇提物对人食管癌CaEs-17细胞的增殖抑制作用，结果表明，转基因天山雪莲愈伤组织醇提物对CaEs-17细胞的增殖抑制作用较强，其 IC50值（0.2874 mg·mL-1）比非转基因愈伤组织醇提物的IC50值（0.3903 mg·mL-1）低26.4%。荧光倒置显微镜观察到人食管癌CaEs-17细胞的生长明显受到抑制，细胞形态发生明显变化，细胞体积缩小，间距变大，相互分离，细胞核高度固缩，细胞成片死亡。 （4）对两种天山雪莲愈伤组织醇提物诱导人食管癌 CaEs-17 细胞凋亡的作用进行分析。流式细胞仪分析结果显示，两种天山雪莲愈伤组织醇提物对CaEs-17细胞均具有明显的细胞凋亡诱导作用，且均呈浓度依赖性，但转基因愈伤组织醇提物对CaEs-17细胞的凋亡诱导作用较强。 （5）运用RT-PCR检测两种天山雪莲愈伤组织醇提物对相关凋亡基因Bcl-2和Bax表达量的影响。结果显示两种天山雪莲愈伤组织醇提物都可以上调促凋亡基因Bax的表达量，呈不断上升的趋势，下调抑凋亡基因Bcl-2的表达量，呈不断下降的趋势，但转基因愈伤组织醇提物的调控作用更加显著。 综上所述，与非转基因愈伤组织相比，转基因天山雪莲愈伤组织醇提物对人食管癌 细胞CaEs-17的抗肿瘤活性显著提高，这与转基因愈伤组织中矢车菊半乳糖苷及其代谢相关类黄酮化合物的含量的大幅度增加有很大关系。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1天山雪莲的研究概况

1.2植物类黄酮和花青苷的研究概况

1.2.1类黄酮简介

1.2.2花青苷简介

1.2.3类黄酮和花青苷的代谢途径

1.2.4类黄酮和花青苷药理活性的研究进展

1.2.5类黄酮和花青苷提取方法的研究进展

1.2.6类黄酮和花青苷鉴定方法的研究进展

1.3植物抗肿瘤活性的研究进展

1.3.2抗肿瘤机制

1.3.3植物花青苷抗肿瘤活性的研究进展

1.3.4抗肿瘤活性检测方法的研究进展

1.4本研究的目的和意义

1.5技术路线

第二章 材料与方法

2.1实验材料

2.2主要试剂与仪器

2.2.1主要试剂

2.2.2主要仪器

2.3实验方法

2.3.1样品制备

2.3.2细胞培养

2.3.3总黄酮含量的测定

2.3.4高校液相色谱分析

2.3.5 CCK-8法检测两种愈伤组织醇提物对CaEs-17细胞增殖的影响

2.3.7流式细胞仪检测细胞凋亡

2.3.8 RT-PCR检测细胞凋亡相关基因的表达量

2.4数据统计分析

第三章 结果与分析

3.1类黄酮成分分析

3.1.1总黄酮含量的测定

3.1.2单体酚的种类和含量分析

3.2抗肿瘤活性分析

3.2.1天山雪莲两种愈伤组织醇提物对CaEs-17细胞的增殖抑制作用

3.2.2天山雪莲两种愈伤组织醇提物处理后的CaEs-17细胞形态变化

3.2.3天山雪莲两种愈伤组织醇提物对CaEs-17细胞凋亡的影响

3.2.4天山雪莲两种愈伤组织醇提物对Bcl-2和Bax基因表达的影响

第四章 结论与讨论

4.1结论

4.1.1类黄酮成分分析

4.1.2抗肿瘤活性分析

4.2讨论

参考文献

附录

缩略词

致谢

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