天山雪莲类黄酮相关基因的克隆及功能分析

摘要

目的：天山雪莲次生代谢物种类非常复杂，其主要药理活性的化合物有黄酮、生物碱和多糖类，其中黄酮中的类黄酮为自然界药用植物中的主要活性成分之一，具有较强的药理作用，属于植物次级代谢产物。但是由于其自然生长速度缓慢，加之人们对其过度采挖，现有的野生资源濒临枯竭，生物多样性受到严重的威胁，因此，寻找野生雪莲的替代品，满足市场需求成了一个亟待解决的课题。
　　方法：本研究用RT-PCR方法克隆SikP和SikTTG1基因并对其生物信息学进行分析，构建植物表达载体，利用农杆菌介导法转化天山雪莲和番茄，用PCR和RT-PCR鉴定转基因植株，分别对转基因天山雪莲叶片和番茄叶片的类黄酮含量进行测定。
　　结果：⑴从天山雪莲叶片cDNA中成功克隆出SikP基因，该基因含有一个783 bp编码261个氨基酸的开放阅读框；SikP基因与水母雪莲的SmP基因序列同源性达96.5％，氨基酸同源性96.9%，所编码蛋白理论等电点为7.64，为碱性氨基酸，相对分子量为29086.5 Da，不存在跨膜域，为亲水性较强的蛋白，不稳定参数为61.23，属于不稳定蛋白。系统发育树表明天山雪莲SikP与水母雪莲SmP蛋白亲缘关系最近并在同一分支上。⑵SikTTG1基因含有一个1011 bp编码337个氨基酸的开放阅读框与水母雪莲的SmTTG1基因序列同源性达97.14%，氨基酸同源性为95.55%，所编码的蛋白质具有WD40结构域，属于WD40家族成员，等电点为4.82，为酸性氨基酸，相对分子量37692.3 Da，不存在跨膜区域，为亲水性蛋白，不稳定参数为52.10，属于不稳定蛋白。系统发育树表明天山雪莲SikTTG1与水母雪莲SmTTG1蛋白亲缘关系最近并在同一分支上。⑶将SikP和SikTTG1基因成功构建植物表达载体pBI121-SikP和pCAMBIA2300-SikTTG1。利用农杆菌介导法转化天山雪莲和番茄，经PCR和RT-PCR鉴定，获得番茄。⑷分别测量转基因天山雪莲叶片和番茄叶片的类黄酮含量，将其与对照作比较，结果发现转SikP基因的天山雪莲类黄酮含量是对照组的9.85倍，转SikP基因的番茄叶片类黄酮含量是对照组的5.4倍，转SmTTG1基因的番茄叶片类黄酮含量是对照组的3.95倍。
　　结论：综上所述，说明天山雪莲Myb转录因子SikP基因和WD40转录因子SmTTG1基因对植物次生代谢具有重要的调控作用，能够有效地提高类黄酮的含量。

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第一章 文献综述

1.1 天山雪莲研究进展

1.1.1 天山雪莲的种类及形态特征

1.1.2 天山雪莲的分布及生态环境

1.1.3 天山雪莲化学成分研究

1.1.4 雪莲的药用价值

1.1.5 天山雪莲的植物组织培养

1.2植物类黄酮次生代谢研究进展

1.2.1 类黄酮的种类

1.2.2类黄酮的作用

1.2.3 类黄酮次生代谢分子调控研究进展

1.2.4植物类黄酮的生物合成途径

1.3类黄酮生物合成途径中的转录调控因子

1.3.1 MYB类转录因子

1.3.2 bHLH类转录因子

1.3.3 WD40类转录因子

1.4本研究的目的和意义

第二章 天山雪莲Myb转录因子SikP基因的克隆及功能分析

2.1 材料与仪器

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌株与载体

2.1.3 试剂盒及主要试剂

2.1.4 主要仪器与设备

2.2 试验方法

2.2.1 SikP基因的克隆

2.2.2 SikP基因的生物信息学分析

2.2.3 SikP基因的植物表达载体的构建

2.2.4 番茄和天山雪莲的遗传转化

2.2.5 转基因番茄和天山雪莲的筛选及鉴定

2.2.6 转基因番茄和天山雪莲总黄酮含量的测定

2.3 结果与分析

2.3.1天山雪莲SikP基因的克隆

2.3.2 SikP基因的生物信息学分析

2.3.3 SikP基因的植物表达载体的构建

2.3.4 番茄和天山雪莲的遗传转化

2.3.5 转基因番茄和天山雪莲的鉴定

2.3.6 转基因番茄和天山雪莲总黄酮含量的测定

2.4 结论与讨论

第三章 天山雪莲WD40转录因子SikTTG1基因的克隆及功能分析

3.1 材料与仪器

3.2 试验方法

3.2.1 SikTTG1基因的克隆

3.2.2 SikTTG1基因的生物信息学分析

3.2.3 SikTTG1基因的植物表达载体的构建

3.2.4 番茄和天山雪莲的遗传转化

3.2.5 转基因番茄的筛选及鉴定

3.2.6 转基因番茄总黄酮含量的测定

3.3 结果与分析

3.3.1天山雪莲SikTTG1基因的克隆

3.3.2 SikTTG1基因的生物信息学分析

3.3.3 SikTTG1基因的植物表达载体的构建

3.3.4 番茄和天山雪莲的遗传转化

3.3.5 转基因番茄的鉴定

3.3.6 转基因番茄总黄酮含量的测定

3.4 结论与讨论

参考文献

附录 实验材料与常规方法介绍

致谢

作 者 简 介

石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表