拟南芥表皮毛发育异常突变体的基因克隆与功能分析

摘要

植物的表皮毛已经被广泛的作为植物细胞发育调控机制的研究模型。为了探索调控植物表皮毛发育的新组分，我们利用正向遗传学的方法在拟南芥突变体库中进行大规模的筛选，发现了四株表皮毛发育明显缺陷的突变体，其中两株的表皮毛均为单分支。通过图位克隆、遗传互补实验，我们证明这两个突变体为STI基因的新等位突变体，且均为隐性突变。STI基因已被报道认为是表皮毛分支调控的关键因子，该基因的表达产物由三个功能域组成，其中间结构域与原核生物DNA聚合酶IIIγ-亚基的序列相似；两个PEST结构域位于N端；另外在该蛋白的N端和C端各有一个细胞核定位信号（NLS）。我们的生化和分子实验证明位于STI N端的第一个PEST结构域对于植物表皮毛分支调控具有重要作用。STI 能够与调控细胞形态和核内复制的关键因子 BRACHLESS TRICHOME (BLT)作用。以往的研究表明STI调控表皮毛分支的功能发挥与DNA复制、肌动蛋白以及微管细胞骨架的聚合无关，我们的研究结果显示STI和BLT之间存在直接作用的结构域，这一结果揭示出STI在细胞形态建成过程中发挥了某种潜在作用。 我们筛选到的另一个突变体其莲座叶上几乎无表皮毛。我们将它命名为F08-01，图位克隆与遗传互补实验证实该突变体是GLABROUS1（GL1）基因的新等位突变体。已知由GL1编码的288个氨基酸组成的蛋白属于R2R3 MYB转录因子。实时定量RT-PCR发现在F08-01突变体中GL1 mRNA表达量显著降低，并且在F08-01突变体中过表达GLI基因能恢复F08-01表皮毛发育缺陷的表型，这表明F08-01是GL1基因的一个新的等位突变体。 GL2正向调控表皮毛的发生，属于表皮毛发育上游信号的最后输出装置，本研究从拟南芥莲座叶表皮毛严重缺失突变体gl2-3（SALK_039825）EMS诱变库中筛选到一株能够逆转gl2-3表皮毛缺失表型的植株，将其命名为M25-01。M25-01莲座叶上的表皮毛性状与野生型相似，遗传学分析表明在M25-01中可能存在一个与GL2连锁的半显性突变位点。通过对M25-01 GL2位点的分子分析发现导致gl2-3突变表型的T-DNA插入在M25-01中依然存在，但是GL2 mRNA微量表达，说明可能是由于GL2 mRNA微量表达使得M25-01逆转了gl2-3表皮毛缺失的表型。我们的研究结果为进一步克隆M25-01基因及发现可能与GL2互作的新因子奠定了基础。

目录

第一章 文献综述

1.1 表皮毛发生的研究进展

1.2图位克隆

1.3 定量RT-PCR

1.4 酵母双杂交系统的原理及用途

1.5 本实验的研究意义

1.6 本实验的研究内容

第二章 拟南芥中两个新STI突变体的基因克隆和功能分析

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

第三章 拟南芥中GL1突变体F08-01的分离鉴定和基因功能分析

3.1 材料和方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

第四章 M25-01的筛选鉴定与遗传学方式分析

4.1 材料和方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

总结

附录

附录1 CTAB提取DNA

附录2实时定量PCR（qPCR）

附录 3 酵母菌株的活化及感受态的制备

附录4 引物序列

参考文献

致谢

作者简介