MdTAS4-siR81（-）靶向MdbHLH3调控苹果果皮花青苷形成机理研究及苹果WD40蛋白家族分析

摘要

花青苷含量决定了苹果果皮颜色，目前关于苹果花青苷的研究主要集中于转录水平，而在转录后水平的研究相对较少，小RNA主要在转录后水平发挥功能从而影响植物的表型。本研究首先从不套袋?澳洲青苹‘绿色果皮和套袋处理后红色果皮小RNA高通量测序结果中找出了差异表达的小 RNA：MdTAS4-siR81(-)。并对 MdTAS4-siR81(-)在果实着色中的功能进行了研究。WD40，bHLH，MYB复合物可通过调控结构基因影响花青苷的形成，目前MYB和bHLH转录因子家族已经在苹果中被全面鉴定，而WD40蛋白还没有相关报道，本研究对苹果新基因组中WD40基因进行了鉴定，分类，进化分析及表达分析。获得了以下结果： 1.小RNA高通量测序结果中，不套袋?澳洲青苹‘绿色果皮中MdTAS4-siR81(-)显著高于套袋?澳洲青苹‘红色果皮。在?澳洲靑苹‘和?新红星‘着色过程中，MdbHLH3 与花青苷含量有一个相同的变化趋势，而 MdTAS4-siR81(-)与 MdbHLH3有一个相反的变化趋势。5‘RACE证明在?澳洲靑苹‘和?新红星‘中MdTAS4-siR81(-)均可靶向切割MdbHLH3。苹果果皮中瞬时过表达MdbHLH3能够促进结构基因MdDFR、MdANS、MdUFGT的表达从而促进花青苷的积累，而瞬时过表达MdTAS4-siR81(-)可抑制 MdbHLH3 的表达进而降低花青苷积累。过表达MdbHLH3 可以使拟南芥种子中原花青素含量增加，而MdTAS4-siR81(-)可以靶向MdbHLH3进而抑制拟南芥种子中原花青素积累。同时过表达MdbHLH3可以使拟南芥幼苗中积累花青苷，而MdTAS4-siR81(-)可以靶向MdbHLH3进而抑制拟南芥幼苗中花青素积累。这些结果表明在苹果果实着色过程中， MdTAS4-siR81(-)可以靶向MdbHLH3调控苹果果皮中花青苷的形成。 2.对苹果新基因进行全面搜索和鉴定，找到346个WD40基因。并根据它们在染色体上的位置命名为MdWD40-1到MdWD40-346。根据结构域组成，将苹果346个WD40基因分成9个亚家族（A-I）。同时对苹果和拟南芥中的WD40基因进行了系统进化分析，结果显示它们被聚成14个不同的组，内含子外显子结构显示每个组有一个相似的结构。此外，共线性分析表明苹果中WD40大规模扩增是由于苹果近代全基因组复制事件所导致。通过GO注释以及与拟南芥同源比对筛选出了与ABA、干旱、低温相关的19个候选基因，定量结果显示 19 个候选基因在不同组织器官中有一个差异表达。通过 ABA，干旱，低温处理，最终找到8个基因（MdWD40-17，24，70，74，219，256，283，307），它们至少响应ABA、干旱、低温三种逆境中的一种。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1花青苷合成途径

1.1.1花青苷合成相关结构基因

1.1.2花青苷合成相关调节基因

1.2小RNA概述

1.2.1小RNA的产生

1.2.2小RNA作用机制

1.2.3小RNA研究方法

1.2.4小RNA的功能研究

1.2.5小RNA生物学功能

1.3 WD40基因的研究

1.3.1 WD40基因的结构

1.3.2 WD40基因的功能

1.4本研究的目的及意义

第二章 MdTAS4-siR81(-)靶向MdbHLH3调控苹果果皮花青苷的形成

2.1试验材料

2.2试验方法

2.2.2实时荧光定量PCR

2.2.3利用5‘RACE验证TAS4-siR81(-)靶基因切割位点

2.2.4小RNA过表达载体构建

2.2.5瞬时转化苹果

2.2.6拟南芥转化及筛选

2.3结果与分析

2.3.1转录组差异表达分析

2.3.2果实着色中花青苷含量变化

2.3.3果实着色过程中MdTAS4-siR81(-)和MdbHLH3表达模式

2.3.4 利用5‘RACE验证MdTAS4-siR81(-)切割靶基因MdbHLH3

2.3.5果皮中MdTAS4-siR81(-)和MdbHLH3瞬时过表达

2.3.6 MdTAS4-siR81(-)及靶基因MdbHLH3稳定转化拟南芥

2.4讨论

2.4.1果实着色过程中MdTAS4-siR81(-)和MdbHLH3的变化趋势

2.4.2利用5‘RACE验证MdTAS4-siR81(-)切割MdbHLH3

2.4.3 MdTAS4-siR81(-)靶向MdbHLH3调控花青苷形成

第三章 苹果WD40蛋白家族的鉴定及表达分析

3.1试验材料

3.2试验方法

3.2.1苹果WD40基因鉴定及染色体定位

3.2.2苹果WD40基因的分类及进化分析

3.2.3苹果WD40基因的内含子/外显子结构

3.2.4苹果WD40基因的共线性分析

3.2.6数据统计及分析

3.3结果

3.3.1苹果WD40基因全基因组鉴定及染色体定位

3.3.2苹果WD40蛋白的分类

3.3.3苹果与拟南芥WD40基因的进化分析

3.3.4苹果WD40基因家族的扩增模式

3.3.5苹果与拟南芥中WD40基因的共线性分析

3.3.6苹果WD40基因GO注释分析

3.3.7苹果WD40基因在不同生长阶段的器官表达模式

3.3.8苹果WD40基因对ABA，干旱，低温胁迫响应

3.4讨论

3.4.1苹果WD40基因家族的鉴定、分类以及进化分析

3.4.2苹果WD40基因的扩增

3.4.3苹果WD40基因与拟南芥WD40基因的共线性分析

3.4.4苹果WD40基因GO分析

3.4.5苹果WD40基因组织特异性表达以及对ABA，干旱，低温的响应

结论

参考文献

附录

致谢

作者简介