紫斑牡丹种子α-亚麻酸合成相关基因克隆与功能验证

摘要

牡丹隶属芍药科（Paeoniaceae）芍药属（Paeoniaceae）牡丹组（section Moutan DC.），是我国重要的观赏花卉及药用植物。由于其种子中富含多种不饱和脂肪酸，特别是α-亚麻酸（α-linolenic acid, ALA），因此牡丹成为我国最具潜力的木本油料作物。紫斑牡丹（Paeonia rockii）作为牡丹组的重要成员，其不饱和脂肪酸含量在9种野生牡丹中最高。为了深入研究和阐释牡丹油脂合成的分子机制，我们对不同发育阶段紫斑牡丹种子进行高通量转录组测序，并构建cDNA文库，筛选并克隆与5个牡丹脂肪酸生物合成和油脂积累相关的基因，研究其表达特性及生化特性，并通过模式植物拟南芥中过表达对其进行功能鉴定。本研究对于阐明牡丹种子油脂积累分子机理，以及进一步提高牡丹及其他油料作物ALA含量具有重要理论意义和应用价值。主要研究结果如下： 1. 从紫斑牡丹种子中克隆了5个脂肪酸去饱和酶基因，分别命名为PrSAD、PrFAD2、PrFAD3、PrFAD6和PrFAD7，其完整编码区序列长度为1191bp、1155bp、1308bp、1230bp和1353bp，分别编码396、384、435、409和450个氨基酸。在5 个脂肪酸去饱和酶的氨基酸序列中均含有一个 FA-acyltransferase 保守结构域。系统进化树显示，上述5个基因编码的氨基酸序列均和芍药中对应的脂肪酸去饱和酶高度同源。 2. 通过紫斑牡丹不同组织的荧光定量PCR分析，发现5个脂肪酸去饱和酶基因在7个不同组织中均有表达，且在雌蕊、雄蕊以及发育的种子中的转录水平较高，而PrSAD、PrFAD6和PrFAD7在叶片中也有较高表达量。其中PrSAD、PrFAD2和PrFAD3在种子授粉后10~80d期间的表达水平持续增加，与牡丹种子发育过程中ALA含量的变化趋势保持一致。PrFAD6和PrFAD7在种子发育过程中的表达无明显变化趋势。 3. 为了详细验证 5 个脂肪酸去饱和酶基因在脂肪酸生物合成中的功能，通过GC-MS对转基因拟南芥株系种子脂肪酸含量和组成进行测定和分析。与野生型拟南芥相比，PrSAD、PrFAD2、PrFAD3过表达拟南芥种子的总脂肪酸含量均显著增加。其中PrSAD过表达拟南芥种子的C16:0、C18:0、C18:1、C20:1和C20:2含量均显著增加。PrFAD2过表达拟南芥种子的C18:1和C20:0含量显著下降， C16:0、C18:0和C18:2含量显著增加，ALA与LA比值下降，而PrFAD3过表达拟南芥种子的C18:2和C20:0含量显著下降，C16:0、C18:1和C18:3含量显著增加，ALA与LA比值增加。异源表达PrFAD6或PrFAD7基因未对拟南芥种子中的总脂肪含量产生明显变化。与WT相比，PrFAD6过表达拟南芥种子中C18:2和C22:1含量明显提高，C18:1和C20:1含量显著降低；PrFAD7拟南芥种子中C16:0、C18:1和C18:3的含量显著增加，C18:2、C20:0和C20:2含量均明显降低。此外，PrFAD6与PrFAD7转基因拟南芥种子中的ALA与LA的比值分别降低和升高。 本研究揭示了PrSAD、PrFAD2和PrFAD3在紫斑牡丹种子总脂肪酸的积累过程中发挥重要作用，PrFAD2、PrFAD3、PrFAD6和PrFAD7 在紫斑牡丹种子ALA的积累过程中均发挥作用，但是PrFAD2、PrFAD3占主导作用，即紫斑牡丹种子中高含量的ALA与其高效的PC衍生途径有直接关系。 的总脂肪含量产生明显变化。与WT相比，PrFAD6过表达拟南芥种子中C18:2和C22:1含量明显提高，C18:1和C20:1含量显著降低；PrFAD7拟南芥种子中C16:0、C18:1和C18:3的含量显著增加，C18:2、C20:0和C20:2含量均明显降低。此外，PrFAD6与PrFAD7转基因拟南芥种子中的ALA与LA的比值分别降低和升高。 本研究揭示了PrSAD、PrFAD2和PrFAD3在紫斑牡丹种子总脂肪酸的积累过程中发挥重要作用，PrFAD2、PrFAD3、PrFAD6和PrFAD7 在紫斑牡丹种子ALA的积累过程中均发挥作用，但是PrFAD2、PrFAD3占主导作用，即紫斑牡丹种子中高含量的ALA与其高效的PC衍生途径有直接关系。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 α-亚麻酸

1.1.1 脂肪酸

1.1.2 α-亚麻酸的来源

1.2 α-亚麻酸的功能

1.2.1 预防心血管疾病

1.2.2 降低胆固醇含量

1.2.3 抗炎作用

1.2.4 抑制癌症发生

1.3 植物ALA合成的基本途径

1.3.1 脂肪酸的从头合成

1.3.2 脂肪酸去饱和过程

1.4 ALA合成中的关键酶

1.4.1 脂肪酸去饱和酶的结构与分类

1.4.2 Δ9硬质酰-ACP去饱和酶

1.4.3 Δ12脂肪酸去饱和酶

1.4.4 Δ15脂肪酸去饱和酶

1.5 研究的目的、意义和技术路线

1.5.1 研究目的和意义

1.5.2 技术路线

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌株及载体质粒

2.1.3 反应酶及试剂

2.1.4 常用培养基

2.1.5 主要仪器

2.1.6 PCR引物和测序

2.2 方法

2.2.2 RNA的提取

2.2.3 cDNA第一条链合成

2.2.4 半定量RT-PCR

2.2.5 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

2.2.6 目的基因扩增

2.2.7 PCR产物回收及纯化

2.2.8 目的片段与pUCm-T载体连接

2.2.9 质粒的提取及纯化

2.2.10 过表达载体的构建

2.2.11 农杆菌GV3101感受态的制备及转化

2.2.12 拟南芥转化及筛选

2.2.13 拟南芥DNA提取

2.2.14 转基因拟南芥脂肪酸含量测定

第三章 结果与分析

3.1 牡丹中ALA合成相关基因的克隆与序列分析

3.2 同源序列比对和系统进化分析

3.3 牡丹中ALA合成相关基因的表达特性分析

3.3.1 牡丹中ALA合成相关基因在不同组织中的表达水平

3.3.2 牡丹中ALA合成相关基因在不同种子发育过程中的表达水平

3.4 重组质粒的双酶切检测和PCR鉴定

3.5 ALA合成相关基因过表达对植株脂肪酸含量及组成的影响

第四章 讨 论

第五章 结 论

参考文献

附录

缩写词

致谢

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