紫斑牡丹斑色形成相关MYB基因克隆与功能分析

摘要

紫斑牡丹（Paeonia rockii）是牡丹组革质花盘亚组的野生种，以花瓣基部独特而规则的花色斑为典型形态特征，受到商业和研究领域的广泛关注。大量研究表明紫斑牡丹基部紫黑色斑是牡丹彩斑的主要遗传来源，但其关于斑色形成的调控机制依然不完善。本研究以紫斑牡丹斑和非斑部位为主要试验材料，以杨山牡丹（Paeonia ostii）和三个带斑牡丹品种为对照材料，三个带斑牡丹品种分别为蓝蝴蝶（Paeonia suffruticosa cv.‘LanHuDie’）、墨池金辉（Paeonia suffruticosa cv.‘MoChiJinHui’）和海黄（Paeonia suffruticosa cv.‘HaiHuang’），课题组前期基于紫斑牡丹花瓣转录组分析，发现两个R2R3-MYB转录因子基因MYB-1和MYB-5在花瓣基部极显著高表达，确定与斑色相关的四个结构基因（CHS、F3’H、DFR、ANS）。通过切片观察、测定细胞液pH值和金属元素量化紫斑牡丹色斑的表型及理化性质，确定斑色形成过程中的差异因素。通过实时荧光定量分析两个转录因子在花瓣不同发育阶段色斑部位与无斑部位的表达量差异，结合类黄酮含量及其代谢途径中的结构基因变化趋势，预测其在斑色形成过程中的作用。最后通过病毒诱导基因沉默试验，从抑制基因表达的角度反向验证基因功能。结果如下： （1）表型和理化性质分析表明，紫斑牡丹斑色的形成主要是由于花青素中芍药素在细胞液泡中大量积累，产生红色和紫色的有色细胞，而槲皮素和木樨草素作为助色素，使细胞中的紫色和红色加深，这些有色细胞集中在花瓣基部的表皮和栅栏组织中，形成色斑。同时花瓣基部细胞呈较凸出的椭球形，金属元素的含量较少，也增强了基部斑色。 （2）试验确定了MYB-1和MYB-5基因的序列，通过生物信息学分析，预测了其结构和功能，构建过表达载体和TRV（烟草脆裂病毒）载体，为后期功能验证奠定基础。通过亚细胞定位和实时荧光定量分析，转录因子MYB-1和MYB-5主要在细胞核中起作用，随着斑色的加深，MYB-1和MYB-5在花瓣基部表达量呈上升趋势，与四个结构基因（CHS、F3’H、DFR、ANS）表达特征一致，其中MYB-5的变化更加显著。当MYB-5基因表达被抑制时，结构基因表达量下降，花瓣斑色变浅。 综合分析，在紫斑牡丹斑色形成的过程中，MYB-1、MYB-5和四个结构基因（CHS、F3’H、DFR、ANS）表达量逐渐增加，使芍药素、槲皮素和木樨草素含量增加，花瓣基部逐渐呈现紫红色斑。同时，细胞形态和金属元素影响了色斑的表现。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 国内外研究进展

1.1.1 观赏植物色斑形成的理化因素

1.1.2 色斑形成的分子机理研究

1.1.3 牡丹色斑形成的研究进展

1.2.1 研究的目的与意义

1.2.2 技术路线

第二章 表型观测及理化性质分析

2.1.1 试验材料

2.1.2 试验仪器及试剂

2.1.3 试验方法

2.2.1 花色指标

2.2.2 解剖观测

2.2.3 花瓣细胞液pH值测定

2.2.4 花瓣金属元素含量分析

2.2.5 类黄酮含量及成分分析

2.3 讨论

第三章 基因预测、克隆及表达分析

3.1.1 试验材料

3.1.2 试验仪器及试剂

3.1.3 试验方法

3.2 结果与分析

3.2.1 紫斑牡丹斑色相关MYB基因克隆

3.2.2 紫斑牡丹斑色相关MYB基因序列分析

3.2.3 系统进化树分析

3.2.4 亚细胞定位

3.2.5 时空表达分析

3.2.6 其他品种中的表达分析

3.3 讨论

第四章 紫斑牡丹MYB-1和MYB-5功能分析

4.1.1 试验材料

4.1.2 试验仪器及试剂

4.1.3 试验方法

4.2.1 过表达载体构建

4.2.2 TRV载体构建

4.2.3 浸染结果

4.3 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

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