猪流行性腹泻病毒高增殖Vero细胞选育、分离鉴定及致肠道靶细胞SIEC病理机制研究

摘要

猪流行性腹泻病（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由病原体猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）感染引起的，不同年龄段的猪均可感染，呈现出水样腹泻、呕吐、水肿等临床症状的一种急性肠道传染病。目前 PED 已在全世界范围内广泛流行，造成大量仔猪的死亡，给猪产业造成重大经济损失。PEDV 主要通过粪-口途径进行传播，但最近报道称 PEDV 也可通过空气进行长距离传播，这意味着PEDV 将对世界猪产业构成严重威胁。截止目前，尽管已建立一系列针对 PEDV 感染的分子生物学检测技术，但尚无针对此类疾病有效疫苗和药物，究其原因主要是因为病毒变异速度快，致病机理不明确，当前可用细胞对 PEDV 的感染率低，以及部分地区毒株流行情况不详导致不能及时有效的预防和治疗该类疾病。针对此问题，本试验通过有限稀释技术筛选对 PEDV 感染呈现出高敏感和高产量 Vero 细胞株；并通过该Vero 细胞株分离鉴定我国西北地区暴发的 PEDV 毒株及特性；利用分离的病毒感染永生化猪小肠黏膜上皮细胞（SIEC），探究 PEDV在靶细胞上的致病机理以及 SSIEC细胞增殖的 PEDV 与 Vero 细胞增殖的 PEDV 病毒的差异。具体研究内容与获得结果如下： 1. 采用有限稀释技术制备单克隆 Vero细胞株，单克隆细胞扩大培养后经间接免疫荧光技术筛选出感染率最高的细胞株作为母系细胞，重复以上操作，经过三次逐级筛选最终获得 4 株理想的单克隆细胞株，命名为 Vero/G2A8C4、 Vero/G2A8D4、Vero/G2A8E7和Vero/G2A8G6。研究发现，1 MOIPEDV感染细胞96 h后，母系细胞感染率仅为15%，Vero/G2A8G6（Vero/G6）单克隆细胞感染率已达到100%；1 MOI PEDV感染120 h后，Vero细胞70～80%已脱落、死亡，而Vero/G6细胞60%以上细胞状态良好，结构完整，表明Vero/G6细胞的耐受能力更强；0.1 MOI PEDV感染后， Vero/G6细胞在24 h时即可检测到阳性细胞,而母系Vero细胞在感染72 h后才检测到阳性细胞，表明在低病毒感染量下，Vero/G6细胞更有利于PEDV病毒的早期诊断。因此 Vero/G6 细胞将为 PEDV 的大量增殖、快速诊断、病毒学研究以及疫苗的制备等方面提供有利的生物工具，同时为预防该类疾病的潜在暴发提供了保障。 2. 从陕西、甘肃、青海、宁夏等西北地区的8个猪场共采集27份有腹泻症状的病死仔猪小肠样品。对肠道及内容物提取病毒 RNA，RT-PCR 鉴定结果显示，导致该地区仔猪病毒性腹泻的主要病原体为PEDV，感染率高达92.6%，猪的传染性胃肠炎病毒（TGEV）的感染率为 18.5%，轮状病毒（RV）的感染率为 0。利用 Vero/G6细胞分离鉴定西北地区暴发的PEDV，获得6株PEDV分离毒株，该6株病毒均能在Vero/G6细胞上稳定传至 40 代；种系发育分析显示，5 株分离毒株隶属于经典毒株，1 株分离毒株为变异毒株；临床症状以及病理变化发现经典毒株 NX1和变异毒株 SX1对 10日龄未断奶仔猪均为强毒株。qRT-PCR 检测发现分离毒株能明显提高肠系膜淋巴结中促凋亡因子BCL-G和JAB1基因的表达量以此促进小肠绒毛上皮细胞的凋亡。 3. 选用已成功构建的 PEDV靶细胞 SSIECs作为试验材料来研究分离毒株 NX1感染后宿主细胞的变化。结果显示，NX1感染 SSIEC细胞后降低 SSIEC细胞中 Na+-K+-ATPases, Ca2+-Mg2+-ATPases酶的活性，抑制SSIEC细胞的增殖，同时也促进SSIEC细胞的凋亡。回归试验显示，SSIEC细胞中增殖的 NX1毒株和 Vero细胞中增殖的 NX1毒株对 7 日龄未断奶仔猪均为强毒株，仔猪的临床症状，小肠病理变化以及测量数据表明SSIEC细胞中增殖的NX1毒株比在Vero细胞中增殖的NX1毒力高，具体表现在腹泻症状和死亡症状出现早、肠系膜淋巴结肿胀明显、周边毛细血管充血更严重、肠系膜淋巴结中促凋亡因子 BCL-G和 JAB1基因的表达量高。本试验通过感染靶细胞系和宿主动物来揭示 PEDV感染的发病机制，为 PEDV相关研究提供了准确而有效的数据支持，同时也为该病的防治、疫苗制备以及深入研究提供了理论基础。

目录

声明

第一章猪流行性腹泻病毒的培养选育，生物学特性与致病机理

1.1猪流行性腹泻病毒的发现及培养选育

1.2 PEDV的生物学特性

1.3 PEDV的致病机理

1.4 PED的临床症状与病理变化

1.5 PED的防控以及研究展望

第二章本研究相关概念和技术路线

2.1 PEDV体外培养适应性差严重影响该类疾病的治疗和防控

2.2我国西北地区PED的流行情况

2.3 PEDV与宿主的相互作用

第三章PEDV高敏感单克隆Vero细胞株的筛选

3.1材料

3.2方法

3.3结果与分析

3.4讨论

3.5小结

第四章西北地区猪流行性腹泻病毒感染情况

4.1材料

4.2方法

4.3结果

4.4讨论

4.5小结

第五章猪流行性腹泻病毒与宿主靶细胞的相互作用

5.1材料

5.2方法

5.3结果与分析

5.4讨论

5.5小结

结论与创新点

结论

创新点

参考文献

致谢

作者简介