牛骨骼肌特异性启动子的筛选及验证

摘要

启动子是基因工程载体的主要构成元件，是调控基因表达的“开关”，对基因的表达有开启和调节的功能。组织特异性启动子又称器官特异性启动子，当这类启动子进行调控时，外源基因往往只能够在一些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的组织特异性。骨骼肌主要分布于四肢，是动物肌肉的一种，属于横纹肌。骨骼肌是机体运动的主要肌群，也是畜牧肉产品的主要组成部分。筛选牛骨骼肌特异性启动子，对于创制高产优质而且安全的转基因肉牛育种新材料具有重要意义。 本研究利用实时荧光定量PCR方法检测牛CAPN3、MYOZ1和MYF6基因在不同类型肌肉组织的表达丰度，筛选出骨骼肌特异性表达较高的基因。然后克隆该基因的启动子区，通过双荧光酶素报告系统筛选出活性较高的启动子，并在细胞中进行验证。研究的结果如下： 1.通过实时荧光定量PCR方法检测CAPN3、MYOZ1和MYF6基因在牛骨骼肌、心肌、胃和小肠中的表达丰度，证明了CAPN3基因和MYF6基因在牛骨骼肌中特异性表达。利用PCR技术克隆CAPN3和MYF6基因启动子序列，成功构建pGL4.10-pCAPN3和pGL4.10-pMYF6真核表达载体。将pGL4.73和启动子表达载体共转至小鼠C2C12细胞系，通过双荧光素酶报告试验，筛选出CAPN3基因启动子为具有较高活性的的牛骨骼肌特异性启动子。 2.分别从牛骨骼肌、心脏和胃分离得到牛骨骼肌卫星细胞、心肌细胞和平滑肌细胞，并通过免疫荧光染色鉴定分离的细胞。将分离的牛骨骼肌细胞诱导分化，定量CAPN3基因在不同分化程度下的表达水平，结果表明在牛骨骼肌细胞分化第5天CAPN3基因的表达丰度达到最高。 3.将牛CAPN3启动子逐渐截短，用不同截短片段启动子构建双荧光素酶报告基因表达载体，与pGL4.73共转染小鼠C2C12细胞，筛选出牛CAPN3核心启动子pCAPN3-216/+90，与生物信息学预测启动子位置相近。 4.用pCAPN3-216/+90替换EGFP-N1的启动子构建表达载体，转染至牛骨骼肌细胞、心肌细胞和平滑肌细胞中，结果显示EGFP报告基因在骨骼肌细胞中特异性表达。将脂肪沉积基因PPARγ的CDS区连接在EGFP-N1-Q7的启动子之后，构建载体EGFP-N1-Q7-PPARγ，转染至牛骨骼肌细胞，在mRNA和蛋白水平检测发现PPARγ基因在牛骨骼肌中表达，证明了本研究筛选的牛骨骼肌特异性启动子可使PPARγ基因在骨骼肌中表达。 综上所述，本研究通过实时荧光定量PCR筛选出CAPN3基因和MYF6基因为牛骨骼肌特异性基因，验证了CAPN3启动子活性大于MYF6启动子活性，并通过逐渐截短筛选出核心启动子区，在细胞水平验证CAPN3核心启动子区可使外源基因EGFP和PPARγ基因在骨骼肌中特异性表达。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 启动子的研究进展

1.2 骨骼肌的结构与功能、发育阶段及其特异性基因

1.3 Calpain家族及CAPN3基因的研究进展

1.4 目的意义

第二章 牛骨骼肌特异性启动子的筛选

2.1 试验材料

2.2 试验方法

2.3 试验结果

2.4讨论

2.5小结

第三章 牛CAPN3基因启动子活性分析及验证

3.1 试验材料

3.2 试验方法

3.3 试验结果

3.4 讨论

3.5 小结

全文结论

创新点及后续研究

创新点

后续研究

参考文献

致谢

个人简历