真菌漆酶高产菌株的筛选、发酵及其酶学性质研究

摘要

漆酶(EC1.10.3.2，对苯二酚∶氧氧化还原酶)是一种含多个铜原子的多酚氧化酶，催化氧化多种芳香族化合物，在木质素矿化降解、腐殖质形成等过程中发挥重要作用。在环境修复、生物漂白与制浆、绿色有机合成、食品加工和生物传感器等领域具有广阔的应用前景。 本文以探索漆酶的高效生产为宗旨，对漆酶高效产生菌株的筛选、发酵产酶、漆酶的分离纯化及酶学性质等方面进行了较为系统的研究和分析，获得了国内外相关研究的最新成果，结果如下： 1.以愈创木酚和a-萘酚均被氧化显色作为检测方法，对14份土壤样品中的产漆酶菌株进行了筛选，分析比较了另外38株不同类别菌株的产漆酶能力，并且对3株高产菌株的漆酶酶学性质进行了比较研究。发现菌株WZFF.W-Y11摇瓶发酵8d的漆酶活力(底物：愈创木酚)达到1165U/mL，漆酶的最适反应温度为55℃，60℃时酶活的半衰期大于60min；最适反应pH为3.5-4.5，在pH3.5-9.0酶活保存率大于90％；是一株产酶活力高、发酵时间短、酶学性质优的漆酶高效产生菌；经形态学鉴定，该菌为烟管菌(黑管菌)Bjerkanderaadusta(Willd.exFr.)Karst.。 2.通过正交实验、均匀设计研究了烟管菌WZFF.W-Y11产漆酶的发酵条件。结果表明，摇瓶发酵产漆酶的最佳培养基组成是：淀粉24g、葡萄糖24g、豆饼粉4.8g、NH4Cl3.2g、KH2PO43.2g、MgSO4·7H2O0.2g、CuSO4·5H2O0.006g、麸皮水解液1％、水1000mL、pH6.5。在28℃、150r/m、50mL/250mL的摇瓶培养条件下发酵5d，产酶活力达到了9672±954U/mL(底物：愈创木酚)。 3.烟管菌WZFF.W-Y11的粗酶液经过丙酮分级沉淀、DEAE-Cellulose离子交换层析、SephadexG-100凝胶过滤，得到了三种电泳纯的漆酶同工酶，总酶活回收率达到65.5％，其中LacA达到48.2％；平均纯化了18.7倍，LacC纯化了18.5倍、LacA纯化了29.2倍；三种同工酶的分子量分别为LacA：68.7KD、LacB：80.2KD、LacC：77.2KD。 4.研究测定了LacA、LacC的酶学性质。发现LacA、LacC氧化愈创木酚的Km大于氧化ABTS的Km，最适反应温度在45℃-70℃，最适反应pH3-5.5，65℃时LacC比LacA稳定，LacC在pH4-6稳定，LacA在pH7-8稳定，Al3+对LacC、LacA的酶活有促进作用，Cl-、Fe3+、Hg2+抑制LacC、LacA的酶活，Cu2+抑制LacC的酶活，而对LacA没有明显的影响。

目录

文摘

英文文摘

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第一章 文献综述

第二章 漆酶高产生菌株的分离筛选与鉴定

第三章 烟管菌合成漆酶的液体培养条件研究

第四章 烟管菌WZFF.W-Y11菌株漆酶的分离纯化及部分酶学性质研究

第五章 结论与展望

参考文献

致谢