重组大肠杆菌生产类人胶原蛋白高密度发酵调控与质粒稳定性

摘要

本文主要研究了基因重组Esherichia.coli BL21高密度发酵生产类人胶原蛋白过程。对发酵过程中氨水流加量和氮源对细胞和目标蛋白表达的影响进行考察；结合尾气分析仪分析了发酵尾气成分和有关参数的变化及其对发酵过程的影响；通过质粒平板复制法对类人胶原蛋白大肠杆菌补料分批发酵质粒稳定性进行初步探讨。结果如下： 1.氨水消耗与菌体生长成y=0.0205x<'2>-0.7350x+11.3078的关系；氨水消耗与胶原蛋白生成成y=-1.7643x<'3>+18.4958x+9.5015关系，在胶原蛋白浓度达到5.2415g/L时，氨水消耗量最大。补氨量和菌体浓度的变化趋势较一致，故实际生产中可根据表观补氨速率来估计菌体生长速率，同时可以调节氨水的消耗量来达到最优蛋白表达量。 2.大肠杆菌在延滞期优先利用的氮源为发酵盐中的(NH<,4>)<,2>SO<,4>；指数生长期有机氮源不断被利用；平衡生长阶段菌体对于有机氮源的利用减缓，推断认为胶原蛋白的合成所需要的氮源更多的是来自氨水. 3.延滞期O<,2>消耗加快，CO<,2>释放量逐步增加，到达指数生长期时O<,2>和CO<,2>释放量分别为14.15％和5.47％；指数生长期O<,2>和CO<,2>释放量均维持在一个比较恒定的范围，O<,2>：16.01％-16.77％，CO<,2>：4.58％-5.67％；诱导阶段，O<,2>消耗和CO<,2>释放再次上升，O<,2>和CO<,2>释放量维持于O<,2>：13.85％-14.00％，CO<,2>：6.85％-7.53％。 4.延滞期OUR较低(小于0.05mol/L·h)，CER迅速升高；指数生长期，CER和OUR分别从最高峰0.3501 mol/L·h和0.209 mol/L·h迅速下降至最低值0.331 mol/L·h和0.208 mol/L·h；在补充氮源后二者表现出过渡态，在诱导之前CER、OUR分别升高到0.338mol/L·h和0.229mol/L·h；诱导阶段，CER、OUR分别维持于0.35mol/L·h和0.32 mol/L·h附近。 5.RQ和氨水消耗量关系Y=-0.46224exp(-x/12.08825)+0.94072。拐点即氨水消耗量为20mmol/L。拐点之前，RQ值随氨水消耗量的增加而增加，RQ值大于0.5小于0.85；在拐点之后，RQ值则落于0.9以上。可以通过氨水的消耗量近似估计菌体的代谢情况。 6.卡那霉素浓度与质粒稳定性的指数方程：Y=-37.1663exp(-x/2.28407)+89.66901，进而得到拐点在卡那霉素浓度为0.00606 g/L，所以为了保证发酵过程中的质粒稳定性，卡那霉素浓度添加量不应小于0.006g/L。 7.从质粒稳定性的角度，分批补料和诱导阶段控制μ=0.15较为理想；μ=0.10的情况菌体细胞得率与产物得率小于μ=0.15；在μ=0.25与μ=0.20的情况下细胞质粒丢失速率很快。

目录

文摘

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声明

第一章综述

1.1胶原蛋白

1.1.1胶原蛋白的结构与类型

1.1.2胶原蛋白的生物学功能及应用

1.1.3类人胶原蛋白

1.2高密度发酵

1.2.1补料-分批发酵的补料方式

1.2.2高密度发酵的影响因素

1.3基因工程菌的质粒稳定性

1.3.1质粒不稳定的类型

1.3.2遗传因素对质粒稳定性的影响

1.3.3培养条件对于质粒不稳定性的影响

1.4本研究的目的、意义及内容

1.4.1目的与意义

1.4.2实验内容及拟解决的问题

第二章实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1供试菌种

2.1.2主要仪器

2.1.3主要试剂

2.1.4培养基

2.2实验方法

2.2.1培养发酵方法

2.3分析测定方法

2.3.1菌体浓度测定

2.3.2细胞干重测定

2.3.3残糖测定

2.3.4 NH2-R测定

2.3.5质粒稳定性的测定方法

2.3.6温度、转速、溶解氧浓度(DO)、pH、补料速度测定

2.3.7尾气成分的测定

2.3.8总蛋白浓度测定

2.3.9胶原蛋白含量测定

第三章氮源及氨水流加对细胞和目标蛋白表达的影响

3.1材料与方法(见材料与方法部分)

3.2结果与分析

3.2.1 pH及氨水在发酵过程中变化趋势

3.2.2补料阶段产物形成与氨水流加的关系

3.2.3基质消耗、产物形成与NH4+的关系

3.3本章小结

第四章发酵过程中尾气成分有关参数的分析

4.1材料与方法

4.2结果与分析

4.2.1发酵尾气及发酵过程中OUR、CER、RQ的变化趋势

4.2.2发酵过程中OUR、CER的变化趋势

4.2.3发酵过程中RQ和产物得率

4.2.4对于RQ和氨水消耗量关系的分析

4.3本章小结

第五章类人胶原蛋白大肠杆菌补料分批发酵质粒稳定研究

5.2结果与讨论

5.2.1生长周期对质粒稳定性的影响

5.2.2卡那霉素浓度对于质粒稳定性的影响

5.2.3比生长速率对于质粒稳定性的影响

5.3本章小结

参考文献

致谢