磷酸化突触素Ⅰ及其相关激酶在微波辐射致氨基酸递质释放异常中的作用研究

摘要

目的和意义:近年来，随着微波技术的广泛应用，针对微波辐射的生物效应及有效防护的研究已迫在眉睫。中枢神经系统是微波辐射最为敏感的靶器官之一，微波辐射可引起学习记忆能力下降等中枢神经系统症状，其机制仍有待研究。学习和记忆属于脑的高级功能或高级神经活动，突触可塑性是学习记忆的神经生物学基础。突触可塑性的实质是突触连接结构和突触传递效能的可塑性，其中突触间信号传递通过神经递质的释放来实现。突触素Ⅰ与学习记忆相关的突触结构改变密切相关，且磷酸化的突触素Ⅰ调节突触前神经递质释放，启动突触前的囊泡胞吐，从而完成递质传递过程。微波辐射后神经递质释放异常是学习记忆功能障碍的重要原因之一，但其机制尚不明确。 因此本研究以突触素Ⅰ为靶点，对微波辐射致突触结构损伤及突触前神经递质释放异常的机制进行深入探讨，为微波致中枢神经系统损伤的防治提供理论依据。
　　材料和方法:(1)30mW/cm2微波辐射Wistar大鼠，辐射时间为5min。于辐射后6h，1d，3d，7d，14d及28d，采用Morris水迷宫检测其学习和记忆能力;通过HE染色观察海马组织结构;用Timm染色观察海马苔藓纤维出芽生长;以免疫荧光检测海马原位突触素Ⅰ表达;用高效液相色谱法检测突触体氨基酸递质释放量。以免疫电镜及免疫印迹法检测海马不同位点的磷酸化突触素Ⅰ及囊泡递质转运体的定位及表达。(2)30mW/cm2微波辐射经NGF诱导的PC12细胞，辐射时间为5min。于辐射后1h，6h，12h，1d，2d及3d，采用高效液相色谱法检测氨基酸递质释放量;以免疫荧光及免疫印迹法检测不同位点的磷酸化突触素Ⅰ蛋白表达;进一步采用RNAi沉默突触素Ⅰ或给予磷酸化突触素Ⅰ上游激酶抑制剂进行干预。
　　实验结果:(1)微波辐射后大鼠学习和记忆能力及海马结构改变。①学习和记忆能力:30mW/cm2辐射后1d、2d、3d及7d，与假辐射组相比，平均逃避潜伏期明显延长(p＜0.05或p＜0.01)。②海马结构:30mW/cm2组部分神经元固缩深染，尤以齿状回颗粒细胞和CA3区锥体细胞损伤较重;血管周围间隙增宽。辐射后6h～7d，30mW/cm2组损伤程度呈逐渐加重趋势;辐射后14d，损伤仍存在，但有所恢复;辐射后28d，损伤基本恢复正常。③海马苔藓纤维出芽:学习和记忆后可见海马苔藓纤维由齿状回向门区内出芽生长，微波辐射后(即水迷宫后)7d和14d，30mW/cm2组苔藓纤维出芽生长较假辐射组明显减弱(p＜0.01);28d苔藓纤维出芽生长减弱程度稍恢复(p＜0.05)。(2)微波辐射后大鼠海马突触素Ⅰ、磷酸化突触素Ⅰ及氨基酸递质转运体蛋白表达改变。①突触素Ⅰ的原位表达改变:突触素Ⅰ在海马CA3区和齿状回神经元轴突及轴突末端表达丰富;与假辐射组相比，30mW/cm2辐射后6h-3d，突触素Ⅰ表达明显减弱，3d最为显著;辐射后7-14d呈恢复趋势;辐射后28d恢复正常。②突触素Ⅰ与磷酸化突触素Ⅰ表达:30mW/cm2辐射后海马突触素Ⅰ表达于辐射后1d明显增加(p＜0.01)、3d显著减少(p＜0.01);30mW/cm2辐射后海马ser-62/67位点的磷酸化突触素Ⅰ于1d和3d显著增加（p＜0.05或p＜0.01），7d后基本恢复正常;ser-553位点的磷酸化突触素Ⅰ表达于辐射后3d明显减少(p＜0.01)，7d和14d明显增加(p＜0.01);ser-603位点的磷酸化突触素Ⅰ表达未见明显异常。③VGAT和VGLUT1表达:VGAT表达于辐射后6h、1d和7d明显增加(p＜0.01)，VGLUT1于辐射后6h和1d表达明显减少(p＜0.05或p＜0.01)，于辐射后7d和14d表达明显增加(p＜0.01)。④磷酸化突触素Ⅰ、VGAT及VGLUT1原位表达:辐射后7d，突触前小亮型囊泡大量堆积，其中VGAT和磷酸化突触素Ⅰ(ser-553)同时富集于堆积的囊泡中，而谷氨酸转运体VGLUT1和磷酸化突触素Ⅰ（ser-62/67）在其中未见明显富集。(3)微波辐射后大鼠海马Cdk5、Calpain和p35/25蛋白表达改变。Cdk5于辐射后6h、3d和7d明显增加，辐射后14d明显减少（p＜0.05或p＜0.01），Calpain于辐射后3d表达明显增加(p＜0.01)，14d表达明显减少(p＜0.05); p25于辐射后1d表达明显减少(p＜0.05)，3d和7d表达明显增加(p＜0.01); p35表达未见明显异常。(4)微波辐射后PC12细胞磷酸化突触素Ⅰ表达改变。磷酸化突触素Ⅰ(ser-62/67)于辐射后6h表达明显增加(p＜0.05);磷酸化突触素Ⅰ(ser-553)于辐射后6h、12h表达明显减少(p＜0.01)，48h表达明显增加(p＜0.01)。(5)目的质粒转染对PC12细胞中突触素Ⅰ及磷酸化突触素Ⅰ蛋白表达的影响。转染目的质粒GV175沉默突触素Ⅰ，与转染对照质粒相比，转染目的质粒后突触素Ⅰ及磷酸化突触素Ⅰ（ser-62/67、ser-553）蛋白表达均明显减少(p＜0.01)。(6)U0126及Roscovitine对微波辐射后PC12细胞磷酸化突触素Ⅰ(ser-62/67、ser-553)及其相关激酶表达的影响。单纯微波辐射后p-ERK及ser-62/67位点突触素Ⅰ磷酸化表达增强(p＜0.05)，给予U0126后二者表达减少(p＜0.01)，辐射并给予抑制剂后二者表达明显减少(p＜0.01);单纯微波辐射后Cdk5表达增强(p＜0.05)，给予Roscovitine后Cdk5表达减少(p＜0.01)，照射并给予抑制剂与单纯照射后相比明显减少(p＜0.01)。ser-553位点突触素Ⅰ磷酸化在单纯微波辐射后减少(p＜0.01)，给予Roscovitine后表达增加(p＜0.05)，辐射并给予抑制剂后表达亦增加(p＜0.01)。(7)微波辐射后氨基酸递质释放量改变。①大鼠海马突触体氨基酸递质释放:与假辐射组相比，30mW/cm2组γ-氨基丁酸释放显著减少(p＜0.01)。②PC12细胞氨基酸递质释放:30mW/cm2微波辐射后GABA及GLY释放明显减少(p＜0.01)。③转染目的质粒GV175对微波辐射后PC12细胞氨基酸递质释放的影响:转染目的质粒后GABA和GLY释放减少(p＜0.01)，而辐射并转染目的质粒协同作用后，与单纯转染对照质粒组、微波辐射组及单纯转染目的质粒组相比，GABA释放明显减少(p＜0.01)。④U0126及Roscovitine对微波辐射后PC12细胞氨基酸递质释放的影响。单纯给予U0126或Roscovitine后GABA和GLY释放减少(p＜0.01)，而辐射并给予Roscovitine后与单纯辐射相比GABA释放明显增加(p＜0.05)，辐射并给予U0126后与单纯辐射相比氨基酸释放未见明显差异。
　　结论:30mW/cm2微波辐射后:
　　1、大鼠空间学习和记忆能力下降;海马齿状回及CA3区神经元结构损伤，苔藓纤维出芽明显受抑制，突触素Ⅰ表达明显减少;表明微波辐射可能通过抑制海马突触素Ⅰ的表达，引发突触结构损伤（表现为苔藓纤维出芽生长抑制），最终导致学习记忆能力下降。
　　2、微波辐射后GABA释放障碍，VGAT表达增加，表明辐射后囊泡摄取GABA增加，运载有GABA的囊泡与突触前膜锚定和胞吐过程存在异常;微波辐射后早期VGLUT1表达减少，后期表达增加，提示微波辐射后早期囊泡谷氨酸转运障碍，后期转运活跃，但对其释放均无明显影响。
　　3、微波辐射后p-ERK依赖的磷酸化突触素Ⅰ（ser-62/67）表达增加，p-ERK活性增加;微波辐射后p-ERK正向调控ser-62/67位点突触素Ⅰ的磷酸化。
　　4、微波辐射后Cdk5依赖的磷酸化突触素Ⅰ（ser-553）表达减少;Cdk5、激活因子p25及其水解酶Calpain的表达增加;VGAT和ser-553位点磷酸化突触素Ⅰ同时富集于突触前堆积的囊泡中;表明微波辐射后Calpain促进p35裂解为p25，Cdk5/p25负向调节磷酸化突触素Ⅰ(ser-553)的表达，使含GABA的囊泡锚定及胞吐障碍，进而导致GABA释放障碍。

目录

声明

缩略词表

摘要

前言

参考文献

第一部分 突触素Ⅰ在微波辐射致学习记忆相关突触结构损伤中的作用

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 微波辐射对大鼠海马磷酸化突触素Ⅰ及其相关激酶的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 磷酸化突触素Ⅰ及相关激酶在微波辐射致PC12细胞氨基酸递质释放异常中的作用

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

全文讨论

全文结论

文献综述 Cdk5对神经元突触前囊泡胞吐和胞吞的调控研究

代表性论著一

代表性论著二

个人简历、在读期间发表论文及参与课题

致谢