胃癌患者唾液蛋白质异常糖基化研究

摘要

背景:国际癌症研究机构的最新资料表明，胃癌是全球最常见的五种恶性肿瘤之一，据《Cancer Statistics in China，2015》统计结果显示，胃癌发病率和死亡率在恶性肿瘤中位列第二。在我国，2015年新增胃癌病例67.9万人，因胃癌死亡人数为49.8万人，胃癌的患病率和死亡率均是世界平均水平的两倍多。目前胃癌的诊断还缺乏特异性标志物。本实验通过比较健康志愿者(Healthy volunteers，HV)，萎缩性胃炎(Atrophic gastritis patients，AG)和胃癌患者(Gastric cancer patients,GC)的唾液糖蛋白糖型差异，评估唾液糖蛋白糖型作为胃癌诊断潜在标志物的可行性。
　　方法:本实验总计收集了201例唾液样本，分为实验组与验证组。首先利用凝集素芯片分析了实验组124例唾液样本（30例HV，30例AG，64例GC），比较HV，AG和GC之间的唾液糖蛋白糖型差异。并且利用唾液芯片和凝集素印迹实验对凝集素芯片结果进行验证。其次，对实验组凝集素芯片数据进行逐步逻辑回归分析，构建AG和GC诊断模型(ModelAG和Model GC)，利用验证组(30例HV，24例AG，23例GC)的凝集素芯片数据对模型进行评估。最后，利用凝集素AAL-磁粒复合体分离AAL识别的岩藻糖基化糖蛋白，通过PNGase F酶切法和次氯酸钠(NaClO)氧化法分别释放糖蛋白上的N-糖链与O-糖链，纯化和除盐后用MALDI-TOF/TOF-MS鉴定糖链的完整结构。
　　结果:凝集素芯片结果显示有15种凝集素识别的糖链结构在HV、AG和GC之间存在显著差异。相较于HV，识别α-D-Man和Fucα-1，6GlcNAc糖链结构的PSA以及识别Bisecting GlcNAc和Complex-type N-glycan with outer Gal糖链结构的PHA-E的归一化后荧光强度(Normalized fluorescent intensities，NFIs)在AG和GC中低表达(p＜0.05);而识别Galβ-1，4GlcNAc(type II)和Galβ1-3GlcNAc(type I)糖链结构的ECA、识别High-Mannose，Manα1-3Man和Manα1-6Man糖链结构的HHL、识别Galβ1-3GalNAcα-Ser/Thr(T)糖链结构的PNA、识别Galα1-3(Fucα1-2)Gal(blood groupB antigen)糖链结构的EEL、识别Galβ1-3GalNAc和GalNAc糖链结构的MPL以及识别αGalNAc和αGal糖链结构的GSL-I的NFIs在AG和GC中高表达(p＜0.05);识别β-D-GlcNA，(GlcNAcβ1-4)n和Galβ1-4GlcNAc糖链结构的DSA、识别(GlcNAc)n和High Mannose-type N-glycan糖链结构的LEL的NFIs在AG中显著上调(p＜0.01);识别Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc和Fucα1-3(Galβ1-4)GlcNAc糖链结构的LTL的NFIs在AG中显著下调（p＜0.01）;识别terminal GalNAc，GalNAcα-Ser/Thr(Tn)和GalNAcα1-3Gal识别的VVA，识别α-Gal，α-GalNAc，Galα-1，3Gal以及与Galα-1，6Glc的BS-I，识别α-orβ-1inked terminal GalNAc，(GalNAc)n和GalNAcα1-3Gal的SBA的NFIs在GC中显著上调(p＜0.01);识别Fucα1-6GlcNAc(core fucose)和Fucα1-3(Galβ1-4)GlcNAc的AAL的NFIs在GC中显著下调(p≤0.001)。
　　利用唾液芯片以及凝集素印迹技术验证凝集素芯片结果，唾液芯片与凝集素印迹实验结果均与凝集素芯片的结果一致。从整体糖链水平着手，聚类分析以及主成分分析共同显示了唾液糖蛋白糖型能够用于区分HV、AG和GC。Model GC诊断模型在验证组中达到的较好的诊断效果(AUC:0.89，敏感度:0.96，特异性:0.80)，能够成功区分出23例GC中的22例，24例AG中的19例，30例HV中的24例;ModelAG诊断模型同样获得了较好的诊断效果(AUC:0.83，敏感度:0.92，特异性:0.72)，能够成功区分出24例AG中的22例，23例GC中的13例，30例HV中的25例。
　　此外，利用MALDI-TOF/TOF-MS鉴定了凝集素AAL分离的糖蛋白上糖链的完整结构，结果显示了AAL分离的糖蛋白的岩藻糖基化糖链类型在HV、AG和GC中存在显著的差异，岩藻糖基化O-糖链种类的数量在胃癌的发展过程中呈现出减少的趋势。值的关注的是，m/z1776.629是HV和AG质谱图中最高强度的糖链峰（岩藻糖基化），在GC中则成为一个低强度的糖链峰。而GC中2个最高强度的糖链峰m/z1730.636和1752.610指示为同一种糖链（二者离子不同，分别为[M+H]+和[M+Na]+），在HV和AG中则是中等丰度的糖链。由此可见，唾液糖蛋白糖型具有成为胃癌诊断标志物的潜能。

目录

声明

摘要

缩略语对照表

第一章 绪论

1．1 糖生物学概述

1．1．1 糖基化

1．1．2 糖组与糖组学

1．1．3 糖组学与疾病

1．2 胃癌的研究概述

1．2．1 胃癌简介

1．2．2 胃癌糖组学研究

1．3 唾液的综合概述

1．3．1 唾液简介

1．3．2 唾液与疾病

1．4 凝集素芯片技术

1．4．1 凝集素

1．4．2 凝集素芯片技术

1．5 本论文的研究目的及意义

第二章 健康志愿者、胃炎、胃癌患者唾液糖型分析

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 实验试剂与仪器

2．2．2 唾液样本的收集与处理

2．2．3 唾液蛋白的荧光标记与浓度测定

2．2．4 凝集素芯片实验

2．2．5 唾液芯片实验

2．2．6 SDS-PAGE凝胶电泳与凝集素印迹

2．3 实验结果

2．3．1 唾液蛋白定量

2．3．2 凝集素芯片实验

2．3．3 唾液芯片验证

2．3．4 凝集素印迹验证

2．3．5 诊断模型的构建与验证

2．4 小结

第三章 凝集素AAL识别的糖蛋白糖链结构鉴定

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 实验试剂与仪器

3．2．2 凝集素AAL分离糖蛋白

3．2．3 N-糖链的分离

3．2．4 O-糖链的分离

3．2．6 MALDI-TOF／TOF-MS鉴定N-／O-糖链

3．3 实验结果

3．3．1 凝集素AAL分离糖蛋白的N-糖链谱

3．3．2 凝集素AAL分离糖蛋白的O-糖链谱

3．4 小结

全文总结

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间取得科研成果