c-Ab1非受体酪氨酸激酶介导的FoxM1磷酸化及其功能研究

摘要

非受体酪氨酸激酶c-Abl广泛存在于哺乳动物各种组织细胞中，通过介导底物蛋白发生酪氨酸磷酸化修饰，参与细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、DNA损伤修复、炎症反应、肿瘤发生形成等生命过程的调控。在正常生理条件下，c-Abl的激酶活性受到严谨调控，被多种细胞因子、氧化应激或DNA损伤应激激活后的c-Abl激酶活性大大提高，通过定位于不同的细胞亚结构发挥不同的生理功能。c-Abl具有重要的功能结构域，其SH3结构域能识别富含脯氨酸的蛋白基序，与底物结合密切相关;其SH2结构域能够识别磷酸化的酪氨酸残基基序;NLS及NES结构域引导c-Abl在细胞核质间穿梭，发挥不同的生理功能。
　　转录因子FoxM1属于FOX家族，它在DNA结合区域上呈翼状螺旋结构，在不同的细胞周期时相中，其表达水平及转录激活活性不同，能够调控细胞周期特异性基因的转录表达，从而参与细胞增殖、细胞周期调控及DNA损伤修复等过程。c-Abl与FoxM1均密切参与细胞增殖、细胞周期调控、细胞信号转导等生理活动，两者之间是否存在联系值得探讨。
　　本研究将就二者间的相互作用、磷酸化修饰、稳定性调节、泛素化修饰降解及其对细胞周期进程的影响等方面进行深入研究。
　　本研究通过免疫共沉淀及免疫印迹证实，c-Abl及FoxM1在人乳腺癌细胞MCF-7内能形成免疫复合物，异源表达的Flag-FoxM1及Myc-c-Abl也存在相互作用，且其相互作用不依赖于c-Abl的激酶活性。通过进一步研究发现c-Abl通过SH2、SH3结构域与FoxM1相结合，且SH2结构域的结合能力更强。由于SH2结构域能够识别磷酸化的酪氨酸残基序列，提示FoxM1上有酪氨酸磷酸化位点。为此，我们对其酪氨酸磷酸化修饰作进一步研究。
　　通过免疫共沉淀及抗酪氨酸磷酸化抗体检测发现，FoxM1能被c-Abl酪氨酸磷酸化。细胞周期同步化后发现FoxM1酪氨酸磷酸化修饰主要发生于细胞有丝分裂期，提示c-Abl介导的酪氨酸磷酸化修饰可能参与了FoxM1在细胞有丝分裂期的功能调控。随后，质谱分析发现FoxM1存在5个酪氨酸磷酸化位点，分别为Y129、Y272、Y317、Y377和Y590。通过构建磷酸化位点突变体，发现与野生型FoxM1相比，各突变体的磷酸化水平均有不同程度减弱，其中Y272F与Y590F突变体的磷酸化水平减弱最明显，仅为野生型的10％，提示这两个位点是c-Abl介导的主要磷酸化修饰位点。我们接下来的研究工作也将主要围绕这两个磷酸化位点展开。
　　研究过程中发现，在293FT细胞中过表达Myc-c-Abl能够显著提高FoxM1在细胞中的表达水平;并且在小鼠胚胎成纤维细胞中，当c-Abl及其相关基因Arg双敲除后，FoxM1的半衰期缩短，提示c-Abl对维持FoxM1的稳定性有重要作用。随后我们发现，c-Abl能够显著抑制FoxM1的泛素化修饰，并且这种抑制作用依赖c-Abl激酶活性。进一步对FoxM1磷酸化突变体的泛素化修饰进行研究后发现，与野生型FoxM1相比，Y272F与Y590F磷酸化突变体的泛素化修饰明显增强;且Y272/590F双突变体的泛素化水平增强尤为显著。上述结果进一步说明，c-Abl介导的FoxM1酪氨酸磷酸化可抑制其泛素化修饰。
　　随后，我们对FoxM1磷酸化位点突变导致泛素化水平增加的分子机制进行更深入的探讨，发现FoxM1酪氨酸磷酸化位点突变后，与APC/C E3泛素连接酶组份Cdh1的结合作用显著增强。Cdh1能够识别并招募FoxM1通过泛素—蛋白酶体途径降解。至此，我们提出c-Abl促进FoxM1稳定性的机制，即c-Abl通过酪氨酸磷酸化修饰，抑制FoxM1与E3泛素连接酶招募分子Cdh1的结合，并进一步抑制FoxM1经泛素—蛋白酶体途径降解，提高FoxM1在细胞内的稳定性。
　　c-Abl介导的FoxM1酪氨酸磷酸化修饰对细胞周期进程同样具有调控作用。通过流式细胞技术检测细胞周期发现，表达Flag-FoxM1Y590F突变体细胞的有丝分裂起进程显著缩短，且其细胞周期依赖性蛋白Cyclin B1在有丝分裂期的降解显著加快。这一结果提示，c-Abl对FoxM1的磷酸化修饰可显著影响FoxM1对细胞周期的调控作用，具体的机制有待深入研究。
　　综合以上结果，本研究主要进展如下:
　　1）c-Abl与FoxM1能够在细胞内/外相互作用形成复合物;
　　2）c-Abl可介导FoxM1发生酪氨酸磷酸化修饰，且修饰主要发生在有丝分裂期;
　　3）质谱鉴定并通过点突变证实FoxM1的Y129、Y272（通过磷酸化数据库检索发现）、Y317、Y377及Y590位点可被酪氨酸磷酸化修饰，Y272和Y590为主要磷酸化位点;
　　4）c-Abl介导的酪氨酸磷酸化能够提高FoxM1在细胞中表达水平，并提高其稳定性;
　　5）c-Abl介导的酪氨酸磷酸化能够显著抑制FoxM1的泛素化修饰;6）c-Abl介导的酪氨酸磷酸化通过抑制APC/C E3泛素连接酶组份Cdh1对FoxM1的识别招募，进而抑制FoxM1的泛素化修饰;7）表达FoxM1Y590F磷酸化突变体的细胞有丝分裂进程显著加快，提示FoxM1Y590F较野生型FoxM1可能具有更高的转录激活活性。
　　本研究首次证实非受体酪氨酸激酶c-Abl与FoxM1之间存在相互作用，并首次证实转录因子FoxM1能够被酪氨酸磷酸化修饰。c-Abl介导的FoxM1酪氨酸磷酸化具有双向调节作用:一方面可抑制其与Cdh1的结合，进而抑制FoxM1经泛素—蛋白酶体途径降解，提高FoxM1在细胞内的稳定性;另一方面，也会在一定程度上抑制，FoxM1的转录激活活性。这两方面的调控作用相互制约，实现对细胞周期进程的稳态调节。

目录

声明

缩略词表

摘要

前言

1 转录因子FoxM1的结构和功能

2 非受体酪氨酸激酶c-Abl的结构与功能

3 本课题研究的科学问题

材料与方法

1 细胞株、菌株及质粒

2 分子生物学试剂

3 引物设计、载体构建及碱基序列测定

4 质粒的转化与提取

5 细胞的培养、冻存、复苏、传代及转染

6 免疫沉淀及免疫印迹

7 蛋白浓度定量

8 利用流式细胞技术检测细胞周期

9 GST(谷胱甘肽S转移酶)融合蛋白交联琼脂糖珠的制备

结果

1 c-Abl与FoxM1在细胞内形成复合物

2 外源表达的c-Abl与FoxM1可在细胞内发生相互作用

3 c-Abl与FoxM1相互作用的结构域

4 c-Abl非受体酪氨酸激酶能够介导FoxM1酪氨酸磷酸化

5 c-Abl对FoxM1磷酸化主要发生于有丝分裂(M)期

6 c-Abl介导的FoxM1酪氨酸磷酸化位点分析

7 c-Abl激酶可延长FoxM1在细胞中的半衰期

8 c-Abl激酶可抑制FoxM1经泛素化降解

9 FoxM1在细胞内的稳定性依赖c-Abl介导的Y272／Y590位点磷酸化修饰

10 FoxM1磷酸化突变体可加速细胞周期M期进程

讨论

1 c-Abl与FoxM1的相互作用

2 c-Abl介导FoxM1磷酸化修饰

3 c-Abl调节FoxM1经泛素-蛋白酶体途径降解

4 FoxM1的磷酸化修饰对细胞周期进程的影响

结论

参考文献

文献综述 FoxM1与细胞周期

致谢

发表论文 利用双荧光素酶报告系统研究FoxM1转录活性调控