不同病因导致的角膜新生血管发生与周围间质改变关系的实验研究

摘要

目的： 研究不同病因导致的角膜新生血管的发生与角膜间质的改变之间的关系，进一步探讨角膜新生血管发生的机制。 方法： 一、不同病因导致角膜新生血管的动物模型的建立和观察 1、碱烧伤组 选取BALB/C小鼠25只，将直径2mm的圆形滤纸片浸人1mol/1NaOH溶液中15s后取出，滤纸吸出多余溶液，将其贴附于角膜中央，与角膜密切接触40s后取下，生理盐水冲洗结膜囊1min。 2、真菌感染组 选取BALB/C小鼠25只，直径2mm环钻于角膜中央作一轻压痕，尖刀片刮除压痕范围内角膜上皮，覆盖直径为3.5mm的角膜接触镜，微量移液器于层间注入5μl1×108CFU/ml茄病镰刀菌菌液，10-0尼龙线缝合眼睑两针，术后24小时拆除眼睑缝线。 3、缝线组 选取BALB/C小鼠25只，直径2mm的角膜环钻在小鼠角膜中央作压痕，用11-0尼龙线垂直压痕方向作角膜基质缝合，共穿入基质四针。 4、免疫原植入组 选取BALB/C小鼠25只，术前腹腔注射3次0.1g/mlBSA预致敏，32G针头角膜基质注射0.2g/mlBSA。 5、肿瘤细胞植入组 选取BALB/c小鼠25只，32G针头注入角膜基质内注射1×105/ml小鼠纤维瘤细胞悬液。 术后定期行裂隙灯观察角膜新生血管的生长情况以及有无并发症的出现并照相。 二、组织病理学方法检查角膜新生血管的发生情况 各组术后1、3、7、14天分别取2只眼球，制作石蜡切片行HE染色，检查角膜新生血管的发生情况及角膜基质炎症情况等。 三、免疫组织学方法检测血管周围间质的改变与血管发生的关系 各组小鼠术后1、3、7、14天分别取4-6只眼球，制作石蜡切片和冰冻切片进行免疫组织化学检查，观察角膜基质中的明胶酶、HPA及底物perlecan、FAP的表达情况和与血管发生的关系。 四、分子水平分析角膜中bFGF和VEGF-A的表达与新生血管的关系 取碱烧伤组小鼠术后1天、3天、7天、14天和正常小鼠角膜，提取角膜mRNA，RT-PCR方法检测bFGF和VEGF-A的表达情况。 结果： 1、裂隙灯观察动物模型新生血管的生长情况 (1)碱烧伤组：术后3天NV侵入角膜，术后7-14天达到生长旺盛期，血管走行较直分布于全层，术后14天开始逐渐退缩。(2)真菌感染组：术后3天NV呈袢状侵入角膜，术后7天NV呈毛刷状，较迂曲，生长旺盛。术后14天血管逐渐变细消退。(3)缝线组：术后3天少量NV伸入角膜。术后7天NV呈三角形生长，到达缝线处。拆除缝线后，血管迅速消退，至术后14天仅残留少量血管影。(4)免疫原植入组：术后3天NV侵入角膜，术后7天角膜中央水肿混浊加重，全周NV进一步生长，术后14天长入全角膜，但部分血管开始消退(5)肿瘤细胞植入组：术后3天NV伸入角膜，术后7天可见角膜中央混浊灶，术后14天NV长入全角膜，未见明显消退。 2、组织病理学检查角膜新生血管的生长情况 各组术后1天都有不同程度的以中性粒细胞为主的炎症细胞浸润，主要位于角膜损伤区，碱烧伤组炎症细胞最多。术后3天新生血管自角膜缘长入，周围伴大量炎症细胞浸润。术后7天各组基质内都可见大量血管，但分布的区域及深浅存在差异：碱烧伤多分布于中深基质层；真菌感染组多分布较浅；缝线组分布于缝线周围；免疫原植入组和肿瘤细胞植入组多分布于角膜中央，水肿明显。术后14天各组炎症都有不同程度减轻，仍有部分血管残留。 3、免疫组织化学检测间质的改变 (1)MMP-2和MMP-9的表达：术后MMP-12和MMP-9主要来源于中性粒细胞为主的炎症细胞，术后1天血管生长之前各组即可检测到其不同程度表达，7天后表达逐渐下降。不同实验组表达情况存在一定差异。碱烧伤组：表达最多，基质板层纤维间成片表达，分布于全层；真菌组：主要在中央溃疡区的浅基质层表达，多呈散在分布的形式；缝线组：表达量最少，主要由缝线周围浸润的炎症细胞产生；免疫原植入组和肿瘤植入组：都主要表达在角膜中央基质注射区，肿瘤组表达持续时间长。 (2)HPA的表达：主要来源于炎症细胞，术后1天在角膜缘检测到表达，术后3天随着新生血管的长入表达范围进一步扩大，且大部分位于新生血管周围特别是前端，7天表达逐渐下降。各组HPA的表达存在一定差异：碱烧伤组表达量最多，分布于基质全层，真菌感染组、免疫原植入组和肿瘤细胞植入组表达情况相似，主要表达在角膜基质浅层；缝线组表达最少，术后早期仅有少量的炎症细胞表达HPA。 (3)perlecan的表达：真菌感染组术后3天角膜缘出现perlecan+细胞，部分新生血管基底膜出现表达，7天perlecan+细胞逐渐减少，表达perlecan的血管增多；术后14天大多数血管基底膜都表达perlecan。 (4)FAP的表达：FAP+细胞位于CD31表达阳性的血管内皮细胞周围，与血管内皮细胞伴行生长，两者无明显的先后顺序，各组表达情况类似。 4、RT-PCR检测 结果显示，术后3天bFGF和VEGF-A表达开始上调，至术后14天开始有所下降。 结论： 1、碱烧伤、真菌感染、缝线法、免疫原植入和肿瘤细胞植入法都可以建立角膜新生血管模型。 2、新生血管发生时血管周围间质发生了改变：1)大量明胶酶(MMP-2和MMP-9)和HPA的出现使ECM和基底膜发生不同程度的降解，减小基质内的阻力，为血管的长入开辟道路。2)血管周围出现了perlecan+细胞为血管内皮的迁移起“脚手架”的作用。3)出现了FAP+细胞，包绕血管并伴随血管内皮生长，为内皮细胞的增殖和移动开路同时也起到支架作用。 3、不同病因所致的新生血管模型中明胶酶的表达存在一定差异，导致角膜ECM不同程度的降解，影响了新生血管的形态和生长方式。碱烧伤组明胶酶在基质的板层纤维间成片表达，分布于基质全层，因此新生血管具有生长速度快、走行较直、分布全层的特点。真菌感染组明胶酶主要在溃疡区的浅基质层表达，多呈散分布，这可能与血管多呈毛刷状、较迂曲，分布较浅有关。缝线组明胶酶主要由缝线周围浸润的炎症细胞产生，表达量最少，因此新生血管多朝向缝线方向，呈三角形分布，远离缝线的区域角膜相对透明；拆除缝线后明胶酶表达明显减少，血管很快消退。免疫原植入和肿瘤细胞植入组明胶酶多分布在角膜中央基质注射区，使血管得以长入全角膜。肿瘤细胞植入组表达持续时间较长，因此血管也存在较长时间。

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