线性泛素化连接酶LUBAC高通量底物筛选体系的建立

摘要

蛋白质泛素化修饰在细胞周期进程、信号转导、DNA损伤修复等多种细胞生命进程中发挥重要的调控作用。常见的泛素化修饰可按照在泛素分子上的赖氨酸残基位置分为以下七种泛素连接形式：K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63位泛素化修饰，又可根据泛素的数目分为单泛素化修饰和多聚泛素化修饰。不同的泛素连接形式发挥不同的生物学功能，如单泛素化修饰多参与膜转运和胞内吞，而多聚泛素化修饰中，K48位多聚泛素化修饰最常见，是26S蛋白酶体的降解信号，K63位多聚泛素化修饰主要是参与DNA损伤修复和信号转导，K11位多聚泛素化修饰参与细胞周期过程中的蛋白质降解。蛋白泛素化过程涉及包括泛素激活酶（ubiquitin activating enzyme，E1），泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme，E2)和泛素连接酶（ubiquitin ligase，E3）在内一系列酶的级联反应。在ATP供能的情况下，E1酶连接泛素，泛素分子的赖氨酸残基被激活，E1将激活的泛素转移给E2酶，E3酶识别底物蛋白，E2酶携带激活的泛素与E3酶结合，将泛素连于底物上，完成对底物的泛素化修饰，在不同蛋白质的泛素化修饰过程中E3酶起关键作用。2006年日本大阪大学Kazuhiro Iwai教授实验室发现了一种新的泛素化修饰，其泛素连接形式不是已知的泛素内部赖氨酸相关的，而是泛素首尾相连形成线性泛素化链，即一个泛素单体N端的甘氨酸与上一个泛素单体C端的甲硫氨酸之间形成线性泛素化链，称为线形泛素化修饰。
　　在已知发现的600多种E3酶中，LUBAC(linear ubiquitin chain assembly complex)复合物是目前已知唯一的导致蛋白质发生线性泛素化修饰的E3酶。该复合物由HOIP（HOIL-1-interacting protein，又称RNF31、ZIBRA或PAUL)、SHARPIN（Shank-associated RH domain-interacting protein）和HOIL-1L（longer isoform of haem-oxidizediron-regulatory proteinubiquitin ligase1）组成，其中HOIP是核心组分，主要行使线性泛素化E3酶的活性，HOIP的突变或缺失均不能使该复合物发挥线性泛素化修饰E3酶的功能。
　　自从线性泛素化修饰和线性泛素化E3酶LUBAC被发现后，人们对LUBAC的功能和底物产生了极大兴趣。目前报道LUBAC复合物的底物有NEMO（NF-kappa-B essential modulator）、TRIM25（ISG15 ligase TRIM25）、RIPK2（Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase2）和ASC（Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD）。初步发现的线性泛素化修饰的生物学功能主要体现在先天性免疫和抑制炎症反应等过程，更多的由线性泛素化所调控的生物学功能尚待探索，因此系统筛选和鉴定LUBAC的线性泛素化底物对于充分理解线性泛素化的生物学功能具有重要意义。本论文拟采用新型的CRISPR/Cas9基因编辑技术结合高分辨亲和质谱分析技术，建立高通量线性泛素化位点鉴定和底物筛选体系，为进一步深入探索线性泛素化的生物学功能提供线索。
　　CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences)技术作为一种最新涌现的基因组编辑工具被广泛应用。CRISPR/Cas9技术通过单链向导RNA(single guide-RNA，sgRNA)对目的基因上下游进行靶标并招募Cas9核酸酶对DNA双链进行切割，利用细胞非同源性末端接合(non-homologous end joining，NHEJ)的DNA修复机制的不准确性，从而达到敲除目的基因的作用[9]。和锌指核酸酶技术（Zinc-finger nuclease，ZFN）和转录激活样效应因子核酸酶技术（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）相比，CRISPR/Cas9技术更简单更容易实现，也越来越受瞩目，是目前靶向基因编辑的重要技术。
　　作为蛋白质组学研究的重要工具，质谱分析在蛋白翻译后修饰类型识别、位点鉴定、结构解析以及定量测定等方面发挥着不可或缺的作用。质谱技术的发展有力推动了蛋白翻译后修饰研究，促进修饰位点的鉴定效率、覆盖率、定位精确度以及定量准确度不断提高。目前以质谱技术为核心蛋白质组学分析平台对于包括泛素化在内的多种翻译后修饰研究正在向精细化、规模化、协同化和定量化的方向发展。复杂生物体系中的翻译后修饰蛋白通常具有丰度低、动态范围广以及不均一性等特点，为获得高的鉴定效率和准确度，常需针对含有修饰位点的蛋白或肽段开发特异性的纯化/富集方法。目前对于泛素化的富集策略主要有在肽段层面针对K-diGly残基的特异性抗体免疫纯化方法和在蛋白层面基于UBD结构域的亲和纯化方法等。这些技术为在蛋白质组层面进行深入的规模化蛋白泛素化鉴定提供了有利条件。采用质谱技术结合特异性的亲和纯化方法对包括线性泛素化在内的蛋白翻译后修饰位点进行协同式鉴定和量化分析将有力推动线性泛素化的生物学功能研究。
　　LUBAC复合物除具有线性泛素化E3酶的活性外，其组分（如Sharpin和HOIL-1L）能使蛋白发生其他类型的泛素化修饰(如K48,K63)等。为尽可能特异性地鉴定出线性泛素化修饰蛋白质，排除其他类型泛素化修饰的干扰，本项研究的策略是首先在HeLa细胞中使用CRISPR/Cas9系统将LUBAC的核心组分HOIP敲掉后，再外源瞬转HOIP野生型（ HOIPWT）和HOIP线性泛素化酶失活型（HOIPCS），以LUBAC的已知底物NEMO的线性泛素化作为体系的阳性对照，通过亲和质谱分析鉴定泛素化肽段，系统比较两组样品的泛素化蛋白和位点的差异，从而推测LUBAC新的未知底物。首先，我们参照CRISPR在线设计网站（http://crispr.mit.edu）选定了2条高评分的CRISPR敲除序列，将其构建到lenti-CRISPRv2载体上，通过慢病毒包装系统构建出稳定敲除HOIP效果良好的HeLa细胞系。之后，在敲除细胞基础上构建了过表达HOIP野生型和HOIP线性泛素化E3酶失活型的细胞体系，并在此细胞体系中观察到LUBAC已知底物NEMO线性泛素化的发生，验证了HOIP与NEMO的酶和底物关系。
　　综上，我们利用CRISPR/Cas9技术和蛋白质组学相结合的方法，建立了在敲除内源HOIP的基础上转染E3酶和酶活突变型的细胞体系，在此基础上，我们拟通过规模化的亲和质谱蛋白质组学分析鉴定LUBAC新的底物，发现LUBAC新的功能，探索线性泛素化参与调控不同细胞生物学功能的具体机制，扩展人们对线性泛素化修饰调控细胞功能的认识。

目录

声明

缩略词表

前言

材料与方法

1.3主要仪器

2.2 CRISPR敲除HOIP细胞系的构建

2.3 CRISPR敲除HOIP的HeLa细胞中表达HOIPWT和HOIPCS

2.4免疫共沉淀方法检测线性泛素化修饰

2.5质谱鉴定

2.6统计学方法

实验结果

2 利用CRISPR稳定敲除细胞系，构建用于LUBAC底物筛选的阳性细胞体系（HOIPWT组和对照细胞体系HOIPCS组）

2.3稳定表达外源HOIPWT和HOIPCS体系中LUBAC已知底物NEMO线性泛素化的检测

3瞬时表达HOIPWT和HOIPCS体系中NEMO线性泛素化的检测

4质谱方法验证阳性体系的建立以及LUBAC底物的初步鉴定结果

讨论

总结

参考文献

附录

附录1 NEMO线性泛素化位点鉴定的原始谱图

附录2 LUBAC底物筛选对照组线性泛素化蛋白质谱鉴定结果

附录3 LUBAC底物筛选实验组泛素化蛋白质谱鉴定结果

发表文章:利用CRISPR/Cas9慢病毒系统敲除人源HOIP基因

个人简历

致谢