流式微球技术检测肾损伤标志物方法学建立及初步临床应用

摘要

背景：流式微球技术(cytometric bead array,CBA)是一种新兴的分子生物学技术，因其检测灵敏度高、特异性强、分析速度快等优点，在医学领域具有广阔的应用前景并得到快速发展。Cys C、NGAL、IL-18和KIM-1是近年来分别被发现，并经多中心临床验证的急性肾损伤新型生物标志物。大量研究表明，这几种标志物与慢性肾脏病(chronic kidney diseases,CKD)也有紧密关联，但目前多数研究只是针对其中一种或两种标志物，联合检测这四种标志物在CKD诊断和病情进展中的作用未见报道。过去，对这几种标志物的检测多采用ELISA方法，但ELISA标本用量大、操作繁琐且不能实现联合检测。本课题拟用成熟的抗体标记微球的方法，在CBA技术和流式细胞仪平台的支持下，将四种生物标志物纳入研究体系，建立CBA技术同时检测多个肾损伤标志物的方法并初步探讨其在CKD诊断和转归中的作用。
　　目的：建立CBA技术同时检测多个肾损伤标志物的方法，并进行方法学评价，筛选CKD不同病情程度的血浆标本进行临床验证并初步探讨CBA技术同时检测多个肾损伤标志物在CKD诊断及转归中的作用。
　　方法：
　　1.选择配对抗体：以选取的四种生物标志物为抗原，选择针对每个抗原的捕获抗体和检测抗体，每个抗体对要针对抗原的不同抗原表位，曾用于ELISA试剂盒、Luminex或CBA实验。
　　2.功能微球的包被及稳定性验证：首先，四种标志物的捕获抗体与BDTMCBA含不同分类荧光的聚苯乙烯微球偶联。偶联结束后，利用BD Biosciences公司提供的种属与同微球结合的抗体种属来源匹配的PE anti-Ig Detector来检测微球-抗体结合效果，并在不同时间重复操作验证已包被微球的稳定性。
　　3.CBA技术检测肾损伤标志物方法学建立：利用CysC、NGAL两种标志物进行预实验，在PE-链霉亲和素足量的前提下，对二者最高检测限及检测抗体浓度进行探索和优化，同时优化实验条件和实验步骤并对稀释倍数进行探索。然后，根据预实验结果，将其余二种标志物加入其中，继续对后加入两者的最高检测限及检测抗体浓度进行调整和优化。最后，对PE-链霉亲和素的浓度进行滴定，最终确保四种标志物标准曲线最优化并建立CBA技术同时检测多个肾损伤标志物的方法。
　　4.方法学性能评价：参考美国国家实验室标准委员会文件结合CBA技术特点执行，包括灵敏度、检测范围试验、重复性试验、干扰试验和回收试验。灵敏度即最低检测限，将四种标志物的最低浓度管(0管除外)作倍比稀释后制成灵敏度检测时的梯度标准管进行灵敏度检测，记录MFI值，能够区分的最小MFI值所对应的浓度即为灵敏度。根据方法学建立中对四种标志物最高检测限的确定，结合灵敏度即最低检测限的结果，最终确定四种标志物的检测范围。本研究同时操作三组平行标准溶液进行批内重复性试验，用变异系数CV对批内重复性试验进行评价，变异系数在5％之内认为可以接受；将其中一组平行标准溶液放置4℃冰箱保存，于标记后24h和48h测定四种标志物含量进行批间重复性试验，用相对偏差和曲线相关系数对批间重复性试验进行评价，相对偏差绝对值在10%之内，相关系数在95%以上认为可以接受。本研究根据检测样本类型选取白蛋白作为干扰物，单独标志物标准溶液与混合标志物标准溶液同时作CBA检测进行四种标志物相互间干扰试验，用干扰率对两种类型的干扰进行评价，干扰率在5%之内认为可以接受。本研究将微量已知浓度标准品加入到混合标准溶液中，根据基础样品管和分析样品管的测定浓度，计算回收率，以评价该方法的系统误差，回收率在95%-105%之间认为可以接受。最后，参照四种标志物ELISA试剂盒说明书，对建立的CBA方法与成熟ELISA方法的性能指标进行比较。
　　5.CBA技术检测肾损伤标志物初步临床应用：用CBA和ELISA方法测定CKD不同病情程度患者(Scr≤178umol/L归入A组，Scr＞178umol/L归入B组)和正常对照者血浆中四种标志物含量，采用SPSS16.0进行统计学分析，对计量资料进行正态分布检验和方差齐性检验。正态分布资料采用(xSD)表示，组间差异性分析采用成组t检验。非正态分布资料采用中位数(四分位数间距)表示，组间差异性分析采用Kruskal-Wallis秩和检验。四种标志物与Scr、GFR的相关性分析采用spearman相关分析。运用ROC曲线和赋值分类[5]法对四种标志物在CKD诊断中的价值进行评价。组间临床基本资料的比较分析采用x2检验。P＜0.05认为差异有统计学意义。评价两种方法检测四种标志物的符合程度，同时，初步探讨四种标志物在CKD诊断和转归中的作用。
　　结果：
　　1.在微球包被后第0day、7day、1month、2month、3month、4month分别进行包被效果及稳定性验证，结果表明：四种标志物捕获抗体与微球成功偶联，且稳定性良好。
　　2.本研究成功建立了CBA技术同时检测多个肾损伤标志物的方法，四种标志物标准曲线相关系数R2均达到99.7%以上。其中，梯度标准品最佳稀释倍数为3倍，最高检测限分别为CysC100000pg/ml、NGAL50000pg/ml、IL-1825000 pg/ml、KIM-180000pg/ml，检测抗体最佳工作浓度分别为：Cys C0.05μg/ml、NGAL0.1μg/ml、IL-180.05μg/ml、KIM-10.1μg/ml，PE-链霉亲和素最佳工作浓度为0.125μg/ml。
　　3.四种标志物灵敏度分别为CysC3.81pg/ml、NGAL7.62pg/ml、IL-180.24pg/ml、KIM-11.52pg/ml。四种标志物检测范围分别为CysC3.81-100000pg/ml、NGAL7.62-50000pg/ml、IL-180.24-25000pg/ml、KIM-11.52-80000pg/ml。批内重复性试验变异系数在可接受范围内(CV<5%)，批间重复性试验中，24h相对偏差在可接受范围内(相对偏差<10%)，48h测定结果相对偏差不可接受且此时标准曲线相关系数较低(R2<85%)。干扰试验结果显示：四种标志物间无明显干扰(干扰率均在+5%之内)，100g/L之内的白蛋白对联合检测四种标志物无明显影响，回收试验结果显示:四种标志物的回收率均在可接受范围(100%+5%)之内。
　　4.CBA与ELISA方法检测同种标志物在同一组中的含量均不同且差异具有统计学意义(P＜0.05)；两种方法的检测结果经同种统计学方法分析后能得出相同的统计学结论。CysC、NGAL水平在正常对照组、A组、B组依次升高，且差异具有统计学意义(P＜0.001)；IL-18水平在三组中的变化差异无统计学意义；KIM-1水平在A组显著增高，并且与正常对照组、B组相比差异具有统计学意义(P＜0.001)；相关性分析结果显示：CysC、NGAL与Scr呈正相关(P＜0.001)、与GFR呈负相关(P＜0.001)，KIM-1与Scr呈负相关(P＜0.05)、与GFR呈正相关(P＜0.05)，IL-18与Scr和GFR均无显著性相关。ROC曲线分析结果显示：CBA检测时，CysC、NGAL、IL-18和KIM-1的AUC分别为0.917、0.951、0.607和0.948，联合检测CysC+NGAL+KIM-1的AUC为0.997；ELISA检测时，CysC、NGAL、IL-18和KIM-1的AUC分别为1.000、0.956、0.640、0.861，联合检测CysC+NGAL+KIM-1的AUC为0.999；两种方法检测时，联合检测三种指标(CysC、NGAL和KIM-1)的AUC均高于四者联合。
　　结论：
　　1.成功建立CBA技术检测肾损伤标志物的方法，方法学评价良好，符合国际要求及CBA相关专业要求。
　　2.CysC、NGAL、KIM-1可以作为诊断CKD的敏感和特异性指标，前两者含量的变化可以评估CKD的严重程度，而KIM-1在轻度CKD诊断的准确性最高。
　　3.CysC、NGAL、KIM-1三者联合检测对CKD的诊断价值大于CysC、NGAL、KIM-1和IL-18四者联合。

目录

声明

缩略词表

前言

1.急性肾损伤相关的新型生物标志物

2.慢性肾脏病与急性肾损伤的关联

3.急、慢性肾损伤标志物的检测

第一部分 功能微球的包被及稳定性验证

(一)实验材料

(二)实验方法

(三)实验结果

(四)讨论

第二部分 流式微球技术检测肾损物伤标志物方法学建立

（一）实验材料

(二)实验方法

(三)实验结果

(四)讨论

第三部分 流式微球技术检测肾损伤标志物方法学性能评价

(一)实验材料

(二)实验方法

(三)实验结果

(四)讨论

第四部分 流式微球技术检测肾损伤标志物初步临床应用

（一）实验材料

(二)实验方法

(三)实验结果

(四)讨论

结论

参考文献

与学位论文相关的该研究领域文献综述（全文）

在学期间发表的与学位论文密切相关的代表性论著（全文）

个人简历

致谢