量子点流式微球技术定量检测半乳甘露聚糖方法学建立及初步临床应用

摘要

目的:
　　以曲霉菌细胞壁特殊成分—半乳甘露聚糖（Galactomannan，GM）作为研究对象，构建一种便捷、灵敏度高、特异性高、可定量测定曲霉菌半乳甘露聚糖的检测方法。
　　方法:
　　1.光学显微镜、电子显微镜、流式细胞仪对聚苯乙烯微球进行初步观察。
　　2.酶联免疫吸附试验检测聚苯乙烯微球偶联抗体能力。
　　3.共价偶联法制备生物素化抗体。
　　4.EDAC偶联法制备链霉亲和素化量子点(QDs-SA)。
　　5.聚苯乙烯微球与抗体采用EDAC偶联法进行偶联，微量BCA蛋白质定量法观察免疫诊断微球稳定性。
　　6.量子点流式微球技术定量检测血清半乳甘露聚糖方法学建立，对其精密度、线性范围、灵敏度、回收率、干扰率、方法学比对等进行初步评价。
　　7.量子点流式微球技术定量检测半乳甘露聚糖方法、国外Platelia Aspergillus试剂盒和国内半乳甘露聚糖ELISA试剂盒对临床血清标本进行检测，对检测方法诊断效能进行受试者工作曲线（ROC）分析。
　　8.量子点流式微球技术定量检测半乳甘露聚糖方法对临床血清标本进行检测;western blot法和全自动免疫荧光定量分析仪mini-VIDAS对临床血清标本进行降钙素原检测。
　　结果:
　　1.2μm、5μm、10μm聚苯乙烯微球形态规则圆润、粒径均一性好、无畸形球、无微球碎片、微球分布均匀、无粘黏现象，微球表面孔穴丰富。
　　2.羧基化聚苯乙烯微球偶联抗体能力显著强于未羧基化聚苯乙烯微球，共价偶联的抗体生物活性未受明显影响。
　　3.成功制备链霉亲和素化量子点与生物素化抗体，生物素化抗体生物活性未受到明显影响，与链霉亲和素化量子点可发生特异性结合。
　　4.鼠抗半乳甘露聚糖抗体最佳偶联浓度为100μg/mL;链霉亲和素化量子点最佳使用浓度为20nmol/L;生物素化抗体最佳使用浓度为8μg/L;最佳偶联时间为2h;免疫诊断微球储存于4℃环境中可维持65d稳定性。
　　5.量子点流式微球技术定量检测半乳甘露聚糖方法线性范围、灵敏度、变异系数优于国内半乳甘露聚糖ELISA试剂盒;本方法回收率为97.57％-104.96％，总平均回收率为100.76％;50μg/mL-200μg/mL胆红素对本方法检测结果无明显影响;两种方法检测结果相关性较好。
　　6.量子点流式微球技术定量检测半乳甘露聚糖方法诊断效能优于国内半乳甘露聚糖ELISA试剂盒;本方法与国际公认商品化Platelia Aspergillus试剂盒诊断效能相近;两种方法检测半乳甘露聚糖阳性率无显著性差异。
　　7.侵袭性曲霉菌感染组血清半乳甘露聚糖水平较正常对照组、脓毒血症组显著升高。
　　8.侵袭性曲霉菌感染组血清降钙素原水平、阳性检出率显著高于正常对照组，低于脓毒血症组，侵袭性曲霉菌感染组降钙素原阳性检出率明显低于半乳甘露聚糖阳性检出率。
　　结论:
　　1.成功制备生物素化抗体和链霉亲和素化量子点，抗体生物活性未受明显影响。
　　2.免疫诊断微球稳定性较好，基本符合临床需要。
　　3.成功创建量子点流式微球技术定量检测半乳甘露聚糖方法，方法学评价良好，符合国际要求，优于国内ELISA试剂盒;检测结果与国内半乳甘露聚糖ELISA试剂盒相关性较好。
　　4.本方法与国外Platelia Aspergillus试剂盒诊断效能相近，诊断效能优于国内ELISA试剂盒，具有良好的临床适用性。
　　5.侵袭性曲霉菌感染患者血清降钙素原水平显著高于正常体检者，可进一步拓展降钙素原新临床意义。

目录

声明

摘要

中英文缩略词

第1章 引言

1 深部真菌感染

2 曲霉菌感染

3 曲霉菌检查

3．1 直接镜检及真菌培养

3．2 高分辨CT

3．3 组织病理学

3．4 聚合酶链反应

3．5 质谱检测

3．6 核酸测序技术

3．7 血清学抗原检查

4 量子点流式微球技术

4．1 微球

4．2 流式徽球技术

4．3 量子点

5 研究内容与意义

6 创新点

第2章 量子点流式微球技术定量检测半乳甘露聚糖方法学建立

1 材料与方法

1．1 材料与设备

1．2 方法

1．3 统计学处理

2 结果

2．1 微球初步观察

2．2 聚苯乙烯微球羧基检测

2．3 QDs-SA检测

2．4 最佳浓度优化

2．5 偶联时间对偶联率影响

2．6 包被微球稳定性

2．7 方法学评价

3 讨论

3．1 侵袭性曲霉菌感染

3．2 曲霉菌检测方法

3．3 流式微球技术

3．4 量子点

3．5 微球选择

3．6 微球羧基化修饰

3．7 微球偶联

3．8 方法学评价

3．9 小结

第3章 初步临床应用

1 材料与方法

1．1 实验标本

1．2 标本采集

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器

1．5 主要试剂配制

1．6 量子点流式微球技术与ELISA法检测GM

1．7 统计学处理

2 结果

2．1 量子点流式微球技术定量检测GM方法

2．2 国内ELISA试剂盒检测GM

2．3 国外ELISA试剂盒检测GM

2．4 诊断效能比较

2．5 曲霉菌感染与PCT和GM关系

3 讨论

3．1 GM诊断意义

3．2 临床初步应用

3．3 IA与PCT

第4章 结论及展望

1 结论

2 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述 流式微球技术及量子点在实验室诊断中的应用进展