HPD 在肺癌中高表达及其调节肺癌恶性表型的分子机制研究

摘要

酪氨酸属于非必需氨基酸，是20种组成蛋白质的氨基酸之一。酪氨酸的分解代谢是在多种代谢酶的催化作用下完成的。酪氨酸（Tyrosine）首先通过酪氨酸氨基转移酶（TAT，Tyrosine Aminotransferase）将氨基转移到α-酮戊二酸上，生成4-羟苯丙酮酸（HPPA，4-Hydroxyphenylpyruvic acid）；其次，4-羟苯丙酮酸双加氧酶（HPD，4-Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase）将4-羟苯丙酮酸氧化为尿黑酸（HGA，Homogentisic acid）；随后，尿黑酸通过尿黑酸加氧酶(HGD，Homogentisate1，2-dioxygenase)转化为4-顺丁烯二酰乙酰乙酸；顺丁烯二酰乙酰乙酸异构酶将其转化为4-延胡索酸乙酰乙酸；最后，4-延胡索酸乙酰乙酸水解酶(FAH，Fumarylacetoacetase)将4-延胡索酸乙酰乙酸分解为乙酰辅酶A和延胡索酸（FA，Fumaric acid）。这两种代谢终产物随后进入三羧酸循环，参与体内重要的能量代谢途径。
　　HPD是酪氨酸代谢途径的一个关键酶，在肾脏和肝脏中高表达，其它组织中低表达或不表达。实验室前期结果表明：HPD在肺癌病人组织及多种肺癌细胞系中异常高表达，并且HPD过表达可以促进肺癌细胞的迁移能力、降低肺癌细胞对化疗药物的敏感性。反之，敲低HPD可抑制肺癌细胞的迁移能力，增强肺癌细胞对化疗药物的敏感性。但HPD在肺癌中异常高表达的调控机制并不清楚，HPD调节肺癌恶性表型的分子机制也尚未明确。基于此，本论文开展了以下研究：
　　第一部分：HPD在肺癌中异常高表达的调控机制的研究。首先，我们构建了HPD上游启动子-2000~+39 bp区域的报告基因系列缺失体，并确认了-779~+39 bp区域是HPD表达的重要调控区域。通过UCSC在线数据库对该区域进行转录因子结合位点的预测，发现该区域含有HNF4α、HNF1α、Nrf2等转录因子的潜在结合位点。利用双荧光素酶报告基因实验证实HNF4α可增强-779~+39 bp区域的转录活性，并具有剂量依赖关系。进一步在肺癌细胞A549及H1299细胞中过表达HNF4α可以剂量依赖的方式上调HPD mRNA及蛋白的表达。反之，敲低A549细胞中内源HNF4α可下调HPD的表达。EMSA实验证实HNF4α在体外可与HPD启动子特定位点结合。通过组织芯片检测肺腺癌病人组织中HNF4α的表达情况，发现HNF4α在肺腺癌病人组织中异常高表达，并且不同肺癌细胞系中HNF4α的表达情况与HPD的表达具有高度一致性。
　　进一步利用肺癌组织芯片检测Nrf2的表达情况，发现尽管Nrf2在肺腺癌/鳞癌病人组织中也呈现高表达，但双荧光素酶报告基因实验表明Nrf2不能激活HPD启动子的转录活性，也不影响A549细胞中内源HPD的表达水平。同样，HNF1?也不能调控HPD的表达。这些结果表明HNF4?是调控HPD在肺癌细胞中高表达的关键转录因子。
　　此外，我们还检测到HPD的表达水平与Ras突变状态之间存在相关性。结果显示Ras突变的肺癌细胞株（Calu-1、A549、H460、H358）的HPD表达水平明显高于Ras野生型的细胞株（SK-MES-1、H1299）。但通过双荧光素酶报告基因实验发现过表达Ras突变体K-RasG12V并不能激活HPD启动子的转录活性，并且Western Blot、RT-PCR也证实K-RasG12V过表达对内源HPD的表达水平无影响。HPD表达水平与Ras突变相关的生理学意义值得进一步探讨。
　　第二部分：HPD调节肺癌恶性表型的分子机制研究。本实验室前期发现HPD在肺癌组织中异常高表达，可促进肺癌细胞的迁移与迁移，并降低Gefitinib诱导的肺癌细胞凋亡。为进一步明确HPD的功能，我们首先采用ELISA方法检测了HPD在480例正常人血清、肺癌病人血清及肺脏良性病变病人血清中的表达情况，发现与正常人及肺脏良性病变病人相比，肺癌病人血清中HPD表达上调。随后，我们检测了HPD不同表达水平的肺癌细胞株之间的迁移能力。结果显示HPD高表达细胞株（A549，Calu-1）的迁移能力明显高于HPD低表达或不表达的肺癌细胞株（H1299，SK-MES-1）。我们进一步采用尾静脉注射裸鼠的肺癌细胞体内转移模型，评价了HPD过表达对肺癌细胞H1299的转移能力的影响。结果显示过表达HPD可以增强肺癌细胞的体内迁移能力。
　　为探讨HPD促进肺癌迁移转移的分子机制，我们构建了HPD-Q375N、R378K两种酶活性突变体，并利用慢病毒构建了过表达野生型HPD或酶活性突变体的H1299稳定细胞株，并进一步采用表达双荧光(GFP和荧光素酶）的慢病毒pCDH-GFP-Luc感染不同细胞株，建立稳定的双荧光稳定细胞株。通过尾静脉注射裸鼠模型及裸鼠活体成像实验发现，HPD可以代谢酶活性依赖的方式促进肺癌细胞体内迁移。
　　此外，我们进一步检测了过表达HPD及各突变体的H1299细胞株对Gefitinib的敏感性。发现HPD过表达可大大降低H1299对Gefitinib的反应性，与前期结果一致。而过表达HPD突变体的两种细胞的凋亡比例与对照组无明显差别，表明HPD降低肺癌细胞对化疗药物的敏感性依赖于其代谢酶活性。
　　我们进一步评价了酪氨酸代谢通路对肺癌细胞的影响。首先在A549细胞中检测了酪氨酸代谢通路中催化酶的表达情况，发现在肺癌细胞中存在酪氨酸代谢酶的高表达，提示酪氨酸代谢异常可能在肺癌发生发展中具有重要作用。随后，我们评价了酪氨酸代谢通路中关键代谢产物酪氨酸、4-羟苯丙酮酸、尿黑酸、延胡索酸等对肺癌细胞增殖、迁移、细胞周期及化疗药物敏感性的影响。结果显示酪氨酸对肺癌细胞增殖、迁移、细胞周期及化疗药物敏感性均无明显调控作用。4-羟苯丙酮酸可以增加肺癌细胞的迁移能力。尿黑酸可降低A549细胞对Gefitinib的敏感性，抑制Bax表达，上调Bcl-2的表达水平；而延胡索酸则可增加A549细胞对Gefitinib的敏感性，上调Bax表达，抑制Bcl-2的表达水平。这些结果表明酪氨酸代谢物对肺癌细胞迁移及化疗药物敏感性起重要调控作用。
　　我们进一步采用RNA-Seq对敲低HPD引起的差异表达基因进行鉴定，发现敲低HPD可引起190个基因上调，185个基因下调。KEGG分类显示参与酪氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢过程的基因高度富集。因此，我们检测了过表达HPD及不同突变体的肺癌细胞中20种氨基酸的相对含量。发现，与对照组相比，过表达HPD可使肺癌细胞中亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、瓜氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、缬氨酸的相对含量降低，而HPD R378突变后，以上9种氨基酸的相对含量又恢复到正常水平，而Q375位点突变与野生型HPD相比则无明显差别，该结果提示HPD R378位点在调控肺癌细胞氨基酸代谢过程中具有十分重要的作用。
　　综上，本研究明确了酪氨酸代谢酶HPD在肺癌中异常高表达的转录调控机制，并首次揭示了HPD以代谢酶活性依赖的方式调节肺癌细胞迁移及化疗药物敏感性。本研究为全面阐明酪氨酸代谢异常在肺癌中的作用提供了功能线索。

目录

声明

主要英文缩略词

前言

1.肺癌的研究进展

2.肿瘤细胞中氨基酸代谢异常

3.4-羟苯丙酮酸双加氧酶HPD

4.HNF4α与肺癌

5.本课题的研究意义

第一部分：HPD在肺癌中异常高表达的调控机制研究

1.材料与方法

1.1主要仪器与设备

1.2实验材料

1.3实验方法

2结果

2.1 pGL3-HPD Promoter系列缺失体的构建

2.2-779～-364bp区域是HPD基因重要的表达调控区域

2.3 HNF4α是HPD基因表达的重要调控因子

2.4 HNF1α对HPD基因表达无明显调控作用

2.5Nrf2对HPD基因表达的调控作用

2.6HPD表达水平与肺癌细胞中Ras突变状态的关联

3.讨论

第二部分：HPD调控肺癌迁移转移及化疗药物敏感性的分子机制研究

1.材料与方法

1.1主要仪器与设备

1.2实验材料

1.3实验方法

2.结果

2.1 HPD在肺癌病人血清中高表达

2.2HPD表达水平与肺癌细胞迁移能力的相关性

2.3过表达HPD可以增强肺癌细胞的体内迁移能力

2.4HPD酶活突变体的建立

2.5 HPD以代谢酶依赖的方式促进肺癌细胞的体内迁移能力

2.6 HPD以代谢酶依赖的方式降低肺癌细胞对化疗药物的敏感性

2.7不同代谢物对肺癌恶性表型的影响

2.8 HPD敲低可引起多种代谢通路相关基因的表达变化

2.9 HPD引起肺癌细胞中氨基酸代谢紊乱

3.讨论

结论

参考文献

附录

溶剂配置

个人简历

致谢