猪血中纤维蛋白原及凝血酶制备工艺研究

摘要

猪血中含有丰富的营养物质和多种具有生物活性的物质,蕴藏着巨大的开发潜力和利用价值。而大部分猪血被废弃,既浪费了宝贵的生物资源又造成严重的环境污染,利用猪血资源研制和开发高附加值的生化产品,不仅可以增加经济效益,还可以减轻对环境的污染。
　　 本论文以提高猪血的综合利用价值为目的,对从猪血中制备凝血酶及纤维蛋白原工艺流程做了研究。具体研究内容和结果如下:
　　 1.猪血的抗凝处理:收集经检验合格的新鲜猪血,用3.8％的柠檬酸钠溶液与血液按体积比1:9混合抗凝。
　　 2.血浆与血细胞的分离条件:抗凝血浆在4000 r/min,离心10 min,分别收集上清液(血浆)和下层沉淀(血细胞),放在低温下备用。
　　 3.纤维蛋白原提取工艺研究:利用冻融法分离纤维蛋白原。优化后条件为:抗凝血浆在-20℃下冷冻12 h,4℃下解冻,2500 r/min离心15 min,收集沉淀(纤维蛋白原)和上清液(用来制备凝血酶)。在该条件下制备的样品中纤维蛋白原含量84.3％,纤维蛋白原提取率为88％。
　　 4.凝血酶分离提取工艺:分别采用等电点沉淀法和柠檬酸钡吸附法制备凝血酶原,研究这两种方法的最佳工艺。
　　 (1)等电点沉淀法分离凝血酶原的工艺条件:用去离子水将血浆稀释9倍,2％醋酸溶液调节pH5.3,4℃静置过夜,虹吸去上清液,3500 r/min,离心15 min,收集凝血酶原沉淀,沉淀物溶于含0.9％NaCl的0.075％草酸钾溶液,搅拌溶解1h,3500 r/min,离心15 min,收集上清液为凝血酶原粗样液。
　　 (2)柠檬酸钡吸附法分离凝血酶的工艺条件:向血浆加入其体积12％的1mol/L的BaCl2溶液,磁力搅拌1 h后3500 r/min转速下离心15 min,收集柠檬酸钡沉淀,将沉淀溶于等体积的pH8.0的0.2 mol/L EDTA溶液中,搅拌1 h,3500 r/min离心15 min,弃去不容物,上清液用0.05 mol/L pH7.2的Tris-HCl缓冲液透析,至无Ba2+为止。得凝血酶原粗样液。
　　 5.凝血酶纯化:比较用724树脂和纤维素DE-52离子交换层析法纯化凝血酶的效果。用纤维素DE-52离子层析所得到的凝血酶比活与回收率分别为1031.74 u/mg,88.4％;用724树脂纯化的凝血酶比活和回收率分别为126.40u/mg,55.78％,纤维素DE-52纯化效果比较好。
　　 6.凝血酶部分性质的研究:凝血酶作用于纤维蛋白原的最适温度为37℃,pH值为7。
　　 本实验研究了猪血中凝血酶和纤维蛋白原的提取分离工艺,为猪血的综合利用提供了一定的理论依据,使猪血的综合利用程度和附加值都有所提高,为综合利用猪血提供了新的思路和方法。

目录

文摘

英文文摘

1 引言

1.1 课题研究的背景

1.1.1 目前制备猪血生化产品的前景

1.1.2 猪血的作用

1.1.3 利用猪血制备的生化产品

1.1.4 猪血的利用现状

1.1.5 国内外研究现状

1.2 猪血利用难度

1.3 本实验研究的目的和主要内容

2 猪血纤维蛋白原分离提取

2.1 新鲜猪血的预处理

2.1.1 猪血抗凝处理

2.1.2 血浆和血细胞离心分离条件的确定

2.1.3 猪血浆中总蛋白含量的测定—凯氏定氮法

2.2 材料设备与检测方法

2.2.1 材料设备

2.2.2 检测方法

2.3 纤维蛋白原提取工艺实验方案

2.3.1 猪血浆中纤维蛋白原总量的测定

2.3.2 冷冻温度对纤维蛋白原提取分离的影响

2.3.3 冷冻时间对纤维蛋白原提取分离的影响

2.3.4 解冻温度对纤维蛋白原提取分离的影响

2.3.5 离心时间对纤维蛋白原提取分离的影响

2.3.6 离心转速对纤维蛋白原提取分离的影响

2.3.7 冻融法与冷乙醇法制备纤维蛋白原的比较

2.4 结果与分析

2.4.1 猪血浆中纤维蛋白原总量

2.4.2 冷冻温度对纤维蛋白原提取分离的影响结果

2.4.3 冷冻时间对纤维蛋白原提取分离的影响结果

2.4.4 解冻温度对纤维蛋白原提取分离的影响结果

2.4.5 离心转速对纤维蛋白原提取分离的影响结果

2.4.6 离心时间对纤维蛋白原提取分离的影响结果

2.4.7 冻融法与冷乙醇沉淀法制备纤维蛋白原的比较

2.5 本章小结

3 猪血凝血酶的分离提取

3.1 凝血酶制各路线

3.2 材料设备与检测方法

3.2.1 材料设备

3.2.2 检测方法

3.3 凝血酶提取工艺实验方案

3.3.1 等电点沉淀法制备凝血酶原

3.3.2 柠檬酸钡吸附法制备凝血酶原

3.3.3 两种方法提取凝血酶原的比较

3.3.4 凝血酶原的不同激活条件对凝血酶活力的影响

3.4 结果与分析

3.4.1 等电点沉淀法制备凝血酶原

3.4.2 柠檬酸钡吸附法制备凝血酶原

3.4.3 两种方法提取凝血酶原的比较

3.4.4 凝血酶原的不同激活条件对凝血酶活力的影响

3.5 本章小结

4 凝血酶的纯化及部分性质的研究

4.1 凝血酶的纯化

4.1.1 724离子交换树脂法纯化凝血酶

4.1.2 DEAE-纤维素DE-52离子交换法纯化凝血酶

4.1.3 比较分离效果

4.2 凝血酶的部分性质的研究

4.2.1 猪凝血酶最适反应条件

4.2.2 猪凝血酶稳定性的研究

4.3 结果与分析

4.3.1 凝血酶的纯化

4.3.2 凝血酶的部分性质的研究

4.4 本章小结

5 结论与展望

5.1 结论

5.2 讨论与展望

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文目录