改良型环介导等温扩增法检测金黄色葡萄球菌的研究

摘要

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）广泛分布于自然界中，因此，该菌很容易污染食品，严重的甚至会造成食物中毒;金黄色葡萄球菌也是引发临床性疾病的主要病原微生物，当前已有的常规检测方法耗时长、需要专门的仪器设备或专业人才，不利于该菌的快速检测，因此，针对该菌建立一种快速、灵敏的检测方法具有非常重要的现实意义，也将为解决当今食品安全问题提供重要的技术支持。环介导等温扩增法(LAMP)能够高效、快速、准确、灵敏的检测核酸，但该技术在检测过程中易产生假阳性结果，从而限制该技术的广泛应用。本文建立了环介导等温扩增-单分子信标方法，快速、准确地检测金黄色葡萄球菌，并对该方法及其检测特异性、灵敏度等方面进行了研究。
　　本实验确定了金黄色葡萄球菌培养方法、作出了金黄色葡萄球菌的生长曲线，确定了对数生长周期，并对该菌进行了平板计数，为后续LAMP及SMB-LAMP检测方法的灵敏度确定提供了定量结果;通过选取不同的试验方法提取DNA，测定并计算出各种提取方法所得DNA的OD260/OD280，然后用琼脂糖凝胶电泳进行验证实验，最终确定金黄色葡萄球菌基因组DNA的最优提取方法为改良型SDS法;选取金黄色葡萄球菌特异性基因—耐热核酸酶基因nuc作为本实验中LAMP扩增的靶序列，并根据该基因的保守序列在线设计了一套LAMP扩增引物;对该引物的LAMP反应条件进行优化，结果得出:LAMP反应最适温度为60℃，最佳反应时间为45min，dNTPs最佳反应浓度为1.4mmol/L，加入环引物比未加环引物的体系反应快15min;针对所设计的LAMP引物，选取金黄色葡萄球菌2株、大肠杆菌3株、酿脓链球菌1株、沙门氏菌1株进行同步检测，结果只有金黄色葡萄球菌显示阳性，证明了该引物具有良好的特异性;针对提取的DNA模板进行浓度梯度稀释，分别标记:100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，同时，针对隔夜培养的金黄色葡萄球菌液逐渐进行10倍浓度梯度稀释，然后应用改良型SDS法对稀释液分别进行DNA提取，最后对上述两种方法获得的DNA分别进行LAMP扩增，结果证明，LAMP检测金黄色葡萄球菌的检测限为100fgDNA或者100CFU/tube，其灵敏度要比PCR检测该菌的灵敏度高出100倍。
　　在建立的最佳LAMP反应条件基础上，结合单分子信标(SMB)，对金黄色葡萄球菌进行了快速、准确的检测，选定SMB-LAMP的反应条件为上述LAMP优化后的最终结果，并且选定分子信标beacon为0.8μM。为了验证该反应(SMB-LAMP)的特异性，利用金黄色葡萄球菌2株、大肠杆菌1株以及沙门氏菌1株，对所设计的单分子信标进行了验证实验，最后确定根据金黄色葡萄球菌nuc基因所设计的单分子信标具有较高的特异性;同时，对所建立的SMB-LAMP法检测金黄色葡萄球菌的灵敏度进行了确定，最终显示，以金黄色葡萄球菌DNA浓度梯度为SMB-LAMP反应模板时最低检测限为50fg，而以金黄色葡萄球菌液浓度梯度稀释液提取DNA为模板时，最低检测限为6CFU/tube，说明SMB-LAMP较单纯的LAMP具有更强的特异性及灵敏度。

目录

摘要

1 文献综述

1．1 食品安全问题及研究现状

1．2 金黄色葡萄球菌简介

1．2．1 金黄色葡萄球菌生物学性状

1．2．2 金黄色葡萄球菌的致病性及流行情况

1．2．3 金黄色葡萄球菌毒力因子介绍及其致病性

1．2．4 金黄色葡萄球菌的预防

1．3 金黄色葡萄球菌检测技术研究进展

1．3．1 微生物培养法及鉴定方法

1．3．2 免疫学检测法

1．3．3 分子生物学检测法

1．4 DNA提取方法介绍

1．4．1 热裂解法

1．4．2 碱法

1．4．3 CTAB法

1．5 环介导等温扩增法

1．5．1 LAMP方法的概述

1．5．2 LAMP方法的原理

1．5．3 LAMP方法的引物设计

1．5．4 LAMP反应产物的检测方法

1．5．5 LAMP方法的特点及应用

1．6 分子信标简介

1．6．1 分子信标基本原理介绍

1．6．2 分子信标研究应用情况

1．7 研究内容

1．7．1 立题背景及意义

1．7．2 本文研究的主要内容

2 实验材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验菌株

2．1．2 实验仪器及设备

2．1．3 药品与主要生化试剂

2．1．4 实验试剂及配方

2．1．5 主要培养基

2．2 实验方法

2．2．1 金黄色葡萄球菌的培养与保藏

2．2．2 金黄色葡萄球菌的生长曲线的测定

2．2．3 金黄色葡萄球菌的平板计数

2．2．4 金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取

2．2．5 金黄色葡萄球菌基因组DNA提取纯度确定

2．2．6 金黄色葡萄球菌LAMP检测

2．2．7 单分子信标检测金黄色葡萄球菌

3 结果与分析

3．1 金黄色葡萄球菌培养及其生长曲线测定

3．2 金黄色葡萄球菌平板计数检测结果

3．3 金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法比较

3．4 LAMP检测金黄色葡萄球菌引物设计结果

3．5 LAMP检测金黄色葡萄球菌条件优化结果

3．5．1 反应温度对LAMP反应的影响

3．5．2 反应时间对LAMP反应的影响

3．5．3 dNTPs浓度对LAMP反应的影响

3．5．4 引物种类对LAMP反应的影响

3．6 LAMP检测金黄色葡萄球菌特异性结果

3．7 LAMP检测金黄色葡萄球菌灵敏度结果

3．8 SMB-LAMP检测金黄色葡萄球菌实验结果

3．8．1 SMB-LAMP检测金黄色葡萄球菌结果比较

3．8．2 SMB-LAMP检测金黄色葡萄球菌特异性实验结果

3．8．3 SMB-LAMP检测金黄色葡萄球菌灵敏度实验结果

4 结论

5 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文及出版的著作目录

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